molecular mechanisms controlling the diurnal oscillation of r-loop formation in arabidopsis thaliana

Abstract

El rellotge circadiari és un mecanisme cel·lular endogen que sincronitza processos biològics en coordinació amb els cicles de 24 hores del dia i la nit. La funció circadiària és essencial per a la regulació rítmica de processos fonamentals en plantes, incloent-hi, entre altres, el creixement, el desenvolupament i les respostes a l'estrès. El sistema circadiari requereix la regulació precisa de la transcripció rítmica dels gens oscil·lants centrals. Durant la transcripció, a diversos organismes s'ha observat la generació d'estructures genòmiques denominades R-loops, compostes per híbrids DNA-RNA i DNA monocatenari no-motlle.Basant-nos en la correlació que existeix entre la transcripció amb el sistema circadiari i els R-loops, plantegem en aquesta Tesi Doctoral descobrir la possible regulació diürna dels R-loops i identificar els components moleculars i mecanismes subjacents que controlen la seva homeòstasi en Arabidopsis thaliana. Utilitzant assajos tipus dot-blot, hem observat que els R-loops presentaven una regulació diària, amb un enriquiment significatiu durant la nit en comparació amb el dia. Els fotoreceptors (PHYTOCHROME B i CRYPTOCHROME 1 i 2), així com diversos components del rellotge, d'expressió tant diürna com nocturna, contribueixen diferencialment a l'acumulació diària dels R-loops. Aquests resultats ressalten la intricada interacció entre la senyalització lumínica i el rellotge circadiari pel control de l'homeòstasi dels R-loops. A més, hem correlacionat positivament la presència de R-loops amb la transcripció activa, fet que s'ha avaluat mitjançant assajos d'acumulació de l'RNA polimerasa II, d'inhibició farmacològica de la transcripció, de compactació de la cromatina i d'anàlisi de plantes mutants de gens relacionats amb la transcripció. Addicionalment, hem trobat que SSRP1 (structure-specific recognition protein 1), un component del complex FACT (FAcilitates Chromatin Transcription), és necessari per a la correcta acumulació de l'RNA polimerasa II, la compactació de la cromatina, l'abundància de marques d'histones i les respostes al dany del DNA. SSRP1 és també responsable de la regulació diària dels R-loops, reduint la seva acumulació principalment durant el dia. En conjunt, els nostres estudis estableixen una connexió directa de la funció de SSRP1 amb la transcripció i l'acumulació diària de R-loops. Aquests resultats obren noves vies per a la manipulació de la transcripció i la regulació circadiària.

El reloj circadiano es un mecanismo celular endógeno que sincroniza procesos biológicos en coordinación con los ciclos de 24 horas del día y la noche. La función circadiana es esencial para la regulación rítmica de procesos fundamentales en plantas, incluyendo entre otros, el crecimiento, el desarrollo y las respuestas al estrés. El sistema circadiano requiere la regulación precisa de la transcripción rítmica de genes del oscilador central. Desde hace algunos años se ha correlacionado la transcripción con estructuras genómicas denominadas R-loops, compuestas por el híbrido DNA-RNA y el DNA monocatenario que no sirve de molde. Basándonos en la correlación que existe entre la transcripción con el sistema circadiano y con los R-loops, planteamos en esta Tesis Doctoral descubrir la posible regulación diurna de los R-loops e identificar los componentes moleculares y mecanismos subyacentes que controlan su homeostasis en Arabidopsis thaliana. Utilizando ensayos tipo dot-blot, observamos que los R-loops presentaban una regulación diurna, con un enriquecimiento significativo durante la noche en comparación con el día. Los fotoreceptores (PHYTOCHROME B y CRYPTOCHROME 1 y 2), así como genes del reloj que se expresan tanto durante el día como por la noche, contribuían diferencialmente a la acumulación diurna de los R-loops. Estos resultados resaltan la intricada interacción entre la señalización lumínica y el reloj circadiano en el control de la homeostasis de los R-loops en Arabidopsis thaliana. Adicionalmente, observamos que los R-loops se correlacionaban positivamente con la transcripción, evaluada mediante la acumulación de la RNA polimerasa II, la inhibición farmacológica de la transcripción, la compactación de la cromatina y el análisis de plantas mutantes de genes relacionados con la transcripción. Encontramos además que SSRP1 (structure-specific recognition protein 1), un componente del complejo FACT (FAcilitates Chromatin Transcription), era necesario para la correcta acumulación de la RNA polimerasa II, la compactación de la cromatina, la abundancia de marcas de histonas y las respuestas al daño del DNA. Adicionalmente, la expresión y función de SSRP1 resultaban esenciales para la regulación diurna de los R-loops, contribuyendo a su menor acumulación principalmente durante el día. En conjunto, nuestros estudios establecen una conexión directa de la función de SSRP1 con la transcripción y la acumulación diurna de los R-loops, y abren nuevas vías de manipulación de la transcripción y regulación circadiana.

The circadian clock is an endogenous timing mechanism that synchronizes biological processes with the 24-hour day and night cycles. Proper circadian function is essential for the rhythmic regulation of fundamental processes in plants, including among others, growth, development, and responses to stress. At its bases, the circadian function relies on the precise regulation of the rhythmic transcription of core oscillator genes. Active transcription also generates in many organisms the so-called R-loops, three-stranded nucleic acid structures composed of the DNA-RNA hybrid and the non-template single-stranded DNA. Based on the correlation of transcription with both the circadian system and R-loops, in this Doctoral Thesis, we aimed to uncover the potential diurnal regulation of R-loops and identify the molecular components and mechanisms underlying R-loop homeostasis in Arabidopsis thaliana. By using dot-blot assays, we found that indeed R-loops accumulated in a diurnal fashion with a significant enrichment during the night compared to the day. The photoreceptors (PHYTOCHROME B and CRYPTOCHROME 1 and 2), as well as morning- and evening-expressed clock components differentially contributed to the diurnal accumulation of R-loops, highlighting the intricate interplay between light signaling and the circadian clock in the control of R-loop homeostasis. R-loops also positively correlated with active transcription as assayed by RNA Polymerase II accumulation, pharmacological inhibition of transcription, chromatin compaction, and analyses of transcription-related mutant plants. We found that the component of the FACT (FAcilitates Chromatin Transcription) complex, SSRP1 (structure-specific recognition protein 1) also contributed to proper RNA Polymerase II accumulation, chromatin compaction, abundance of histone marks, and responses to DNA damage. SSRP1 was also responsible for the diurnal regulation of R-loops by reducing their accumulation predominantly during the day. Altogether, our studies establish a direct connection of SSRP1 function with transcription and the diurnal accumulation of R-loops. Our results open up possible new avenues for the manipulation of transcription and circadian regulation.