Yellow-in-the-dark mutants meet the omics era to unravel light and retrograde signaling in the green algae Chlamydomonas reinhardtii

Abstract

Durant la desetiolació les plàntules passen d'un desenvolupament escotomorfogènic (hipocòtil allargat, cotilèdons tancats i ganxo apical, limitat desenvolupament de les arrels) a fotomorfogènic (hipocòtil curt, cotilèdons oberts i expandits, creixement lateral de les arrels). Durant aquesta transformació, plasts no fotosintètics (anomenats etioplasts) que estan adaptats a la foscor es transformen en cloroplasts fotosintètics i completament funcionals una vegada que perceben llum. Aquest procés està regulat per mecanisme de senyalització per llum força complex i sofisticat que involucra fotoreceptors (principalment fitocroms i criptocroms) i diversos reguladors transcripcionals essencials (PIF, HY5, GLK i proteïnes B-BOX). A més, el mateix plast pot actuar com un detector de senyals ambientals i enviar senyals retrògrads (RS) al nucli per afinar-ne el desenvolupament durant la desetiolació. La manera com això passa segueix sent un misteri, però s'ha demostrat que GUN1 és un regulador central d'aquesta via i que llum i senyals dels cloroplasts convergeixen per regular la biogènesi dels cloroplasts i altres aspectes del desenvolupament de les plàntules, com la separació dels cotilèdons. La desetiolació s'ha estudiat tradicionalment en plantes angiospermes, ja que a causa de la capacitat d'etiolar en foscor. Les gimnospermes, en canvi, poden sintetitzar clorofil·la a la foscor i sempre tenen un cloroplast desenvolupat. Curiosament, els mutants yellow-in-the-dark (i) de l'alga verda Chlamydomonas reinhardtii no poden sintetitzar clorofil·les a la foscor i formen cloroplasts indiferenciats sense capacitat quan les cèl·lules es mantenen en foscor. Però quan aquestes s'exposen a llum poden restaurar completament un cloroplast funcional. Això és sorprenent, ja que aquestes manquen dels components essencials de la senyalització per llum i retrògrada en angiospermes, inclosos els PIF, GLK i GUN1. En aquest treball, desenvolupem un sistema de desetiolació basat en mutants i que ens va permetre estudiar i caracteritzar transcriptòmicament els principals esdeveniments regulats per llum i senyalització retrògrada. En comparar el transcriptoma d'aquestes cèl·lules amb Arabidopsis es va veure que llum i senyalització retrògrada regulen processos biològics similars a les dues espècies. Descobrim que els gens associats a la fotosíntesi ja estan acumulats en nivells alts en cèl·lules etiolades i són lleugerament induïts per la llum, mentre que la senyalització retrògrada reprimeix fortament però transitòriament aquests gens. Els nostres resultats suggereixen que els PIFs i GLKs van evolucionar en plantes angiospermes per conferir un major grau de regulació a aquests gens, i que GUN1 podria haver evolucionat per mantenir reprimits aquests gens. A més, les nostres dades fisiològiques i transcriptòmiques suggereixen que la biogènesi del cloroplast ocorre en dues fases diferents en aquests mutants i de manera similar al que es descriu en plantes angiospermes. A més, mitjançant la construcció de xarxes de coexpressió gènica, identifiquem nous factors de transcripció candidats a regular la biogènesi de cloroplast a Chlamydomonas. Aquest treball exposa una nova mirada sobre la regulació de llum i retrògrada durant la desetiolació.

Durante la desetiolación las plántulas pasan de un desarrollo escotomorfogénico (hipocótilo alargado, cotiledones cerrados y gancho apical, limitado desarrollo de las raíces) a fotomorfogénico (hipocótilo corto, cotiledones abiertos y expandidos, crecimiento lateral de las raíces). Durante esta transformación, plastos no fotosintéticos (denominados etioplastos) que están adaptados a oscuridad se transforman en cloroplastos fotosintéticos y completamente funcionales una vez que perciben luz. Este proceso está regulado por mecanismo de señalización por luz bastante complejo y sofisticado que involucra fotorreceptores (principalmente fitocromos y criptocromos) y varios reguladores transcripcionales esenciales (PIF, HY5, GLK y proteínas B-BOX). Además, el propio plasto puede actuar como un detector de señales ambientales y enviar señales retrógradas (RS) al núcleo para afinar el desarrollo del mismo durante la desetiolación. La manera en la que esto ocurre sigue siendo un misterio, pero se ha demostrado que GUN1 es un regulador central de esta vía y que luz y señales de los cloroplastos convergen para regular la biogénesis de los cloroplastos y otros aspectos del desarrollo de las plántulas, como la separación de los cotiledones. La desetiolación se ha estudiado tradicionalmente en plantas angiospermas, ya que debido a su capacidad de etiolar en oscuridad. Las gimnospermas, en cambio, pueden sintetizar clorofila en la oscuridad y siempre tienen un cloroplasto desarrollado. Curiosamente, los mutantes yellow-in-the-dark (y) de la alga verde Chlamydomonas reinhardtii no pueden sintetizar clorofilas en la oscuridad y forman cloroplastos indiferenciados sin capacidad cuando las células se mantienen en oscuridad. Pero cuando estas se exponen a luz pueden restaurar completamente un cloroplasto funcional. Esto es sorprendente, ya que estas carecen de los componentes esenciales de las señalización por luz y retrógrada en angiospermas, incluidos los PIF, GLK y GUN1. En este trabajo, desarrollamos un sistema de desetiolación basado en mutantes y, que nos permitió estudiar y caracterizar transcriptómicamente los principales eventos regulados por luz y señalización retrógrada. Al comparar el transcriptoma de estas células con Arabidopsis se vio que luz y señalización retrógrada regulan procesos biológicos similares en ambas especies. Descubrimos que los genes asociados a la fotosíntesis ya están acumulados en niveles altos en células etioladas y son ligeramente inducidos por la luz, mientras que la señalización retrógrada reprime fuertemente pero transitoriamente estos genes. Nuestros resultados sugieren que los PIFs y GLKs evolucionaron en plantas angiospermas para conferir un mayor grado de regulación a estos genes, y que GUN1 podría haber evolucionado para mantener reprimidos estos genes. Además, nuestros datos fisiológicos y transcriptómicos sugieren que la biogénesis del cloroplasto ocurre en dos fases distintas en estos mutantes y de manera similar a lo descrito en plantas angiospermas. Además, mediante la construcción de redes de co-expresión génica, identificamos nuevos factores de transcripción candidatos en regular la biogénesis de cloroplasto en Chlamydomonas. Este trabajo expone una nueva mirada sobre la regulación de luz y retrógrada durante la desetiolación.

Seedling de-etiolation is characterized by the transition from skotomorphogenesis (elongated hypocotyl, presence of hook and closed cotyledons, limited root growth) to photomorphogenesis (short hypocotyl, open and expanded cotyledons, lateral root growth); during this shift, dark-adapted non-photosynthetic plastids (etioplasts) transform into fully functional photosynthetic chloroplasts upon transfer to light. This process is regulated by complex but exquisite light signaling pathways that involve photoreceptors (mainly phytochromes and cryptochromes), and several key transcriptional regulators (PIFs, HY5, GLKs and B-BOX proteins. In addition, the plastid itself can act as an environmental sensor and send retrograde signals (RS) to the nucleus to fine-tune its development during de-etiolation. How RS are sent to the nucleus remains a mystery, but it has been shown that GUN1 is a central regulator of this pathway. Importantly, light and chloroplasts signals converge to regulate chloroplast biogenesis and other aspects of seedling development such as cotyledon separation. De-etiolation has been traditionally studied in angiosperm plants, thanks to their ability to etiolate in the dark. In contrast, gymnosperms can synthesize chlorophyll in darkness and always feature a fully developed chloroplast. Interestingly, yellow-in-the-dark (y) mutants of the green microalgae Chlamydomonas reinhardtii are unable to synthesize chlorophylls in the dark and form undifferentiated chloroplasts with no photosynthetic activity under prolonged darkness. Upon exposure to light, they are able to fully restore a functional chloroplast. Remarkably, they lack essential components of light and RS pathways in angiosperms, including PIFs, GLKs and GUN1. In this work, we developed a y mutant based de-etiolation system that allowed us to transcriptomically study and characterize main light and RS events. Comparative analysis with Arabidopsis showed that light and RS regulate similar biological processes in both species. We found that photosynthesis-associated genes are already accumulated at high levels in y etiolated cells and are slightly induced by light, while RS strongly but transiently repress these genes. Our results suggest that PIFs and GLKs evolved in angiosperm plants to confer a higher degree of regulation to these genes, and that GUN1 might have evolved to keep sustained repression of these genes. Moreover, combined physiological and transcriptomic data suggests that chloroplast biogenesis is achieved in two distinct phases in y mutants, similarly to angiosperm plants. Finally, by building gene co-expression networks we identified potential novel transcription factors that regulate chloroplast biogenesis in Chlamydomonas. This work provides new insights in the regulation of light and RS during de-etiolation.