RTP801: a novel regulator of the tRNA ligase complex in Alzheimer's disease

Abstract

[eng] RTP801/REDD1 is a stress-responsive protein overexpressed in neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease (AD) that contributes to cognitive deficits and neuroinflammation. Here we found that RTP801 interacts with HSPC117, DDX1, and CGI-99, three members of the tRNA ligase complex (tRNA-LC), which ligates the excised exons of intron-containing tRNAs and the mRNA exons of the transcription factor XBP1 during the unfolded protein response (UPR). We also found that RTP801 modulates the mRNA ligase activity of the complex in vitro, since RTP801 knockdown promoted XBP1 splicing and the expression of its transcriptional target, SEC24D. On the contrary, RTP801 overexpression inhibited the splicing of XBP1. In this line, in human AD postmortem hippocampal samples, where RTP801 protein levels are upregulated, we found that XBP1 splicing dramatically decreased. In the 5xFAD mouse model of AD, silencing RTP801 expression in hippocampal neurons promoted Xbp1 splicing and prevented the accumulation of intron-containing pre-tRNAs. Finally, the tRNA-enriched fraction obtained from 5xFAD mice promoted abnormal dendritic arborization in cultured hippocampal neurons, and RTP801 silencing in the source neurons prevented this phenotype. Altogether, these results show that elevated RTP801 impairs RNA processing in vitro and in vivo, in the context of AD and suggest that RTP801 inhibition could be a promising therapeutic approach.

[spa] Las enfermedades neurodegenerativas son un conjunto de enfermedades devastadoras principalmente caracterizadas por la pérdida de poblaciones neuronales específicas. Entre las más destacadas se incluyen la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Huntington (EH) o la enfermedad de Parkinson (EP). En los últimos años se ha propuesto que un mecanismo patogénico común en las distintas enfermedades neurodegenerativas es una síntesis proteica alterada. Precisamente, los ARN mensajeros (ARNm) y de transferencia (ARNt) son elementos esenciales para una correcta traducción.

El complejo ARNt ligasa es un complejo multiproteico descubierto en 2011 compuesto por las proteínas HSPC117, DDX1, CGI-99, FAM98B y ASW. Este complejo participa en el procesamiento de los ARNt con intrón y de ARNm específicos, como por ejemplo el ARNm del factor de transcripción XBP1. Concretamente, el complejo ARNt ligasa se encarga de ligar los exones después del corte endonucleolítico. Por lo tanto, un correcto funcionamiento de este complejo es clave para regular el reservorio de ARNt y ARNm de las células.

RTP801 es una proteína de respuesta al estrés cuyos niveles están incrementados en los cerebros de pacientes con enfermedades neurodegenerativas como la EA, la EH o la EP. Resultados previos del grupo demostraron que el silenciamiento de RTP801 en el hipocampo de ratones modelo de la EA y de la EH mejoraba su cognición y reducía su neuroinflamación. Así pues, niveles aumentados de RTP801 parecen ser patológicos para el cerebro. Curiosamente, en resultados preliminares del grupo se observó que RTP801 interaccionaba físicamente con HSPC117 y DDX1, dos de los miembros del complejo ARNt ligasa.

Por este motivo, nuestra hipótesis de trabajo en esta tesis era que los altos niveles de RTP801 en la EA podrían estar afectando el funcionamiento del complejo ARNt ligasa y, por ende, el reservorio de ARNt y ARNm celulares, lo que contribuiría a la exacerbación de la patología.

Así pues, en el primer objetivo de esta tesis hemos estudiado la naturaleza de la interacción entre RTP801 y los miembros del complejo ARNt ligasa.

Mediante la técnica de la inmunoprecipitación, confirmamos la interacción de RTP801 con HSPC117 y DDX1, y, además, observamos que RTP801 también interaccionaba con CGI-99, otro miembro del complejo. A continuación, analizamos si la interacción de RTP801 con el complejo podría estar estabilizando o desestabilizando dicho complejo. Observamos que los niveles proteicos de RTP801 no influían en los niveles proteicos de los miembros del complejo, ni en

neuronas corticales de rata en cultivo ni en células HEK293 humanas. De forma similar, los niveles de RTP801 tampoco afectaban a la expresión genética de DDX1 ni de HSPC117. Estos resultados sugieren que RTP801 no estabiliza los miembros del complejo ARNt ligasa ni tampoco promueve su degradación.

Por el contrario, observamos que los niveles proteicos de DDX1 y de HSPC117 sí que afectaban a los niveles proteicos de RTP801. Concretamente, DDX1 y HSPC117 parecían estabilizar a la proteína RTP801. Por el contrario, los niveles de DDX1 y HSPC117 no regulan la expresión genética de RTP801. Esto indica que la interacción de RTP801 con el complejo puede estar evitando su propia degradación por parte del proteasoma.

Teniendo en cuenta que la interacción de RTP801 con el complejo no parecía estabilizadora ni de carácter estructural, nos planteamos que RTP801 podría estar modulando su actividad ARNm ligasa. Por ello, en el segundo objetivo de esta tesis investigamos el rol de RTP801 en la actividad ARNm ligasa del complejo sobre XBP1, tanto a nivel fisiológico como en el contexto de la EA.

En primer lugar, observamos que el silenciamiento de RTP801 en células HEK293 promovía el empalme de XBP1 y la transcripción de una de sus dianas transcripcionales, llamada SEC24D. Por el contrario, la sobreexpresión de RTP801 en el mismo modelo celular inhibía el empalme de XBP1. Estos resultados indican que RTP801 inhibe el empalme de XBP1 in vitro, puesto que sus niveles están inversamente correlacionados.

En segundo lugar, estudiamos el estado de RTP801, de los miembros del complejo y del empalme de XBP1 en muestras de hipocampo de pacientes de la EA. Confirmamos, como ya habíamos descrito anteriormente, que los niveles de RTP801 están aumentados en pacientes de la EA en comparación con individuos sanos. Sin embargo, los niveles de los miembros del complejo ARNt ligasa permanecían invariables entre condiciones. Sorprendentemente, el empalme de XBP1 estaba drásticamente alterado en el hipocampo de pacientes de la EA. Estos resultados indican que, a pesar de que los miembros del complejo no están alterados en la EA, su actividad parece estarlo. Además, descubrimos que los niveles proteicos de RTP801, de la forma ligada de XBP1 y de la forma fosforilada de una proteína marcadora de estrés reticular (eIF2α) eran muy buenos clasificadores de la presencia o ausencia de la EA.

Por último, usamos ratones modelo de la EA (5xFAD) para estudiar el empalme de XBP1 in vivo, y el papel que RTP801 jugaba en él. Como en trabajos anteriores, inyectamos virus

adenoasociados en el hipocampo de ratones control y de ratones 5xFAD con el objetivo de disminuir la expresión de RTP801 específicamente en las neuronas. Un mes después, aislamos el ARN del hipocampo para analizar el estado del empalme de Xbp1. Observamos que la disminución de la expresión de RTP801 promovía significativamente su empalme, de forma similar a los resultados obtenidos in vitro. Interesantemente, la disminución de la expresión de RTP801 en el hipocampo de ratones 5xFAD también promovía la expresión de una diana transcripcional de XBP1 llamada Bdnf, que resulta ser una neurotrofina muy importante para la plasticidad neuronal, el aprendizaje y la memoria.

Así pues, los resultados del segundo objetivo de la tesis sugieren que RTP801, la cual está incrementanda en el contexto de la EA, inhibe el empalme de XBP1, y muy probablemente lo hace a través de su interacción con los miembros del complejo ARNt ligasa.

Finalmente, en el tercer objetivo de esta tesis exploramos si RTP801 también inhibía la actividad ARNt ligasa del complejo, es decir, si RTP801 podía modular el empalme de los ARNt con intrón. Para ello, aprovechamos el modelo animal descrito en el segundo objetivo y a partir del RNA obtenido aislamos la fracción de ARN que contiene mayormente los ARNt. Una parte de este ARNt lo usamos para experimentos de secuenciación y la otra parte para analizar su posible toxicidad y su funcionalidad.

Con respecto a los experimentos de secuenciación, observamos que los ratones 5xFAD presentaban una acumulación de ARNt inmaduro (pre-ARNt) en el hipocampo, pero solo de aquellas familias de ARNt que presentan intrón. Estos resultados sugieren que en los ratones 5xFAD hay un problema en el procesamiento de ARNt, y específicamente en su empalme.

Para dilucidar si RTP801 podía estar jugando un papel en este empalme aberrante, estudiamos los niveles de pre-ARNt exclusivamente para aquellas familias de ARNt con intrón en el hipocampo de las siguientes condiciones: ratones control y ratones 5xFAD, con o sin disminución de la expresión de RTP801. Sorprendentemente, observamos que casi todos los pre-ARNt se acumulaban en los ratones 5xFAD y que el silenciamiento de RTP801 prevenía este fenómeno. En otras palabras, RTP801 realmente estaba contribuyendo a la acumulación de pre-ARNt con intrón en los ratones 5xFAD, probablemente mediante la inhibición del complejo ARNt ligasa.

En último lugar, analizamos si los ARNt procedentes de los ratones 5xFAD eran tóxicos para neuronas en cultivo, o si afectaban a su arborización. Para ello, transfectamos neuronas

hipocampales en cultivo con ARNt procedente de las condiciones experimentales indicadas anteriormente, y realizamos una inmunofluorescencia. Para ello se utilizó un anticuerpo contra MAP2 para marcar las neuronas y un anticuerpo contra la proteína caspasa 3 activa como marcador de apoptosis incipiente. Observamos que el ARNt transfectado no era tóxico en ninguna de las condiciones, a juzgar por el grado de condensación de la cromatina y por la intensidad y la distribución del marcaje para la caspasa 3 activa. Sin embargo, en referencia al efecto de los ARNt sobre la arborización neuronal, observamos que los ARNt provenientes del hipocampo de ratones 5xFAD inyectados con los virus control inducían un aumento de la ramificación neuronal, el cual era prevenido por el noqueo de RTP801. Estos resultados sugieren que el reservorio de pre-ARNt diferencial de los ratones 5xFAD sin noqueo de RTP801 puede influir en la ramificación de las neuronas, sin llegar a afectar su viabilidad.

En conjunto, en esta tesis demostramos el rol inhibitorio de RTP801 en la actividad ARNm ligasa y ARNt ligasa del complejo ARNt ligasa. Además, presentamos este rol como un nuevo mecanismo patológico en la EA, que puede contribuir a su exacerbación. Por tanto, esta tesis describe una nueva función de la proteína RTP801 la cual tendrá que ser estudiada en mayor profundidad, ya que supone una potencial diana terapéutica para la EA.