Development of a Safer and More Standardized Cell Therapy for Huntington’s Disease using Isolated Stem Cell-Derived Striatal Neuroblast Subpopulations

Abstract

[eng] Neurodegenerative diseases (NDs) are characterized by a selective and irreversible loss of neurons in a specific brain area. NDs are incurable and debilitating, becoming the greatest unmet clinical need of our time. Huntington’s Disease (HD) constitutes an example of a devastating ND, characterized by degeneration of striatal projection neurons (SPNs) leading to motor, cognitive and behavioral symptoms. Cell replacement therapies (CRTs) are distinguished by their potential to replace cells lost during the degenerative process and have shown a great potential to replace degenerated neurons in animal models and in clinical trials in Parkinson’s Disease (PD) and HD patients. In fact, CRT is the only approach currently focused on the structural and functional restoration of atrophied striatal tissue in HD, by replenishing the degenerating SPN population. In recent years, human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a key cell source for CRTs given the scarcity and heterogeneity of previously used fetal-derived neural progenitors. However, hPSCs are prone to acquire genomic alterations in vitro, mainly due to suboptimal culture conditions and inappropriate routines to monitor genome integrity, which poses a challenge to both the safety of clinical applications and the reliability of basic and translational hPSC research. Furthermore, directing hPSCs into specific neuronal types in vitro is complex and the clinical translation of hPSC-derived neural progenitors is limited by the heterogeneity of cell products obtained using existing differentiation protocols. Therefore, clinical translation of CRTs for NDs requires standardization of production procedures for reproducible generation of defined functional cell products, by ensuring the presence of correctly specified target SPN progenitors and the absence of unwanted overly proliferative cell types In this thesis, we have investigated if standardization of cell culture conditions and genomic screening strategies could decrease the prevalence of genomic alterations affecting hPSCs used as starting material in CRTs. We demonstrated that application of a Quality Management System (QMS) such as ISO9001:2015 to standardize cell culture conditions and genomic monitoring routines leads to a striking improvement of genomic stability in hPSCs cultured in vitro, as evidenced by a reduced probability of potentially pathogenic chromosomal aberrations and subchromosomal genomic alterations. We also described that CD200 is a cell surface marker suitable for the enrichment of hPSC-derived striatal neuroblasts (NBs). We set up and optimized an immunomagnetic sorting pipeline which allows for high-yield enrichment of striatal NBs in heterogenous cell populations

resulting from in vitro differentiation. Our data demonstrate that implementation of this approach leads to a reduction of the heterogeneity and batch-to-batch variation of the final cell population. Furthermore, we showed that sorted cell populations are composed of correctly specified, SPN-committed progenitors with the potential to generate different SPN subtypes, which result in a higher yield of neurons with an SPN phenotype upon terminal in vitro differentiation. We also provided evidence thar the use of CD200- based selection at different timepoints of in vitro differentiation results in obtention of cell compositions enriched in different subtypes of postmitotic striatal NBs. Finally, we demonstrate that transplanted selected NBs survive upon intra-striatal transplantation in adult mice with no evidence of graft overgrowth in vivo. In conclusion, our findings underscore the critical need for implementing QMS in academic laboratories engaged in hPSC research to enhance the consistency and safety of applications of hPSC-derived cell products. Additionally, our results highlight the potential of the dual approach of combining standardization of hPSC culture conditions and CD200-based cell sorting of postmitotic striatal NBs before transplantation as a promising strategy to optimize the outcomes of hPSC-derived CRT products after transplantation. These strategies collectively advance the development and translation of safer, effective, and reproducible cell products to be used for clinical CRT applications in HD and potentially other NDs.

[cat] Les malalties neurodegeneratives (NDs) es caracteritzen per una pèrdua selectiva i irreversible de neurones en àrees específiques del cervell. Les NDs són incurables i debilitants, representant la major necessitat clínica no satisfeta del nostre temps. La malaltia o corea de Huntington (HD) és un exemple d'una devastadora ND, marcada per la degeneració de les neurones de projecció estriatals (SPNs), que dona lloc a símptomes motors, cognitius i conductuals. Les teràpies de reemplaçament cel·lular (CRTs) han mostrat un gran potencial per reemplaçar neurones en models animals i assajos clínics per a pacients amb malaltia de Parkinson (PD) i HD. Les CRTs són l' únic enfocament actualment dirigit a la restauració estructural i funcional del teixit estriatal atrofiat en HD, mitjançant la substitució de la població de SPNs. En els últims anys, les cèl·lules mare pluripotents humanes (hPSCs) s'han convertit en una font cel·lular clau per a les CRTs a causa de l'escassetat i heterogeneïtat dels progenitors neuronals derivats de teixit fetal utilitzats prèviament. No obstant això, les hPSCs són propenses a adquirir alteracions genòmiques in vitro, principalment a causa de condicions de cultiu subòptimes i rutines inapropiades per monitorar la integritat del genoma, la qual cosa representa un desafiament per a la seguretat de les aplicacions clíniques de les hPSCs i la fiabilitat de la investigació amb aquest tipus cel·lular. A més, la diferenciació d'hPSCs cap a tipus neuronals específics in vitro és un procés complex, i la translació clínica dels progenitors neuronals derivats d'hPSCs està limitada per l'heterogeneïtat dels productes cel·lulars obtinguts utilitzant els protocols de diferenciació existents. Per tant, el desenvolupament de CRTs per a NDs també requereix l'estandardització dels procediments de producció per a la generació de productes cel·lulars funcionals definits de manera reproduïble, assegurant la presència de progenitors correctament especificats cap al tipus neuronal d'interès i l'absència de tipus cel·lulars no desitjats i amb fenotip excessivament proliferatiu. En aquesta tesi, hem investigat si l'estandardització de les condicions de cultiu cel·lular i les estratègies de detecció genòmica podrien disminuir la prevalença d'alteracions genòmiques que afecten les hPSCs utilitzades com a material de partida en estratègies de CRT. Els nostres resultats demostren que l'aplicació d'un Sistema de Gestió de Qualitat (QMS) com a ISO9001:2015 per estandarditzar les condicions de cultiu cel·lular i les rutines de monitoratge genòmic condueix a una notable millora de la

estabilitat genòmica en les hPSCs cultivades in vitro, evidenciat per una probabilitat reduïda d' adquisició d' aberracions cromosòmiques potencialment patogèniques i alteracions genòmiques subcromosòmiques. També hem descrit que CD200 és un marcador de superfície cel·lular adequat per a l'enriquiment de neuroblastos (NBs) estriatals derivats d'hPSCs. Hem desenvolupat i optimitzat un procés de selecció cel·lular immunognètic que permet un enriquiment altament eficient de NBs estriatals en poblacions cel·lulars heterogènies resultants de la diferenciació in vitro. Les nostres dades demostren que la implementació d'aquest enfocament porta a una reducció de l'heterogeneïtat i de la variabilitat inter-lot de la població cel·lular final. A més, mostrem que les poblacions cel·lulars aïllades mitjançant aquest procés estan compostes per progenitors especificats correctament cap a la generació de diferents subtipus de SPNs, la qual cosa resulta en un major rendiment de neurones amb fenotip de SPN després de la diferenciació terminal in vitro. També proporcionem evidència que l'ús de la selecció basada en CD200 en diferents punts temporals de la diferenciació in vitro permet l'obtenció de composicions cel·lulars enriquides en diferents subtipus de NB estriatals postmitòtics. Finalment, demostrem que els NBs seleccionats i trasplantats sobreviuen després del trasplantament intra-estriatal en ratolins adults sense evidència de sobrecreixement del trasplantament in vivo. En conclusió, les nostres troballes emfatitzen la necessitat d'implementar un QMS als laboratoris acadèmics dedicats a la investigació d'hPSCs per millorar la consistència i seguretat de les aplicacions de productes cel·lulars derivats hPSCs. A més, els nostres resultats destaquen el potencial de l'enfocament dual de combinar l'estandardització de les condicions de cultiu d'hPSCs i la selecció cel·lular de NBs estriatals postmitòtics basada en l'ús del marcador de superfície CD200 abans del trasplantament com una estratègia prometedora per optimitzar els resultats dels productes derivats d'hPSCs després del trasplantament. Col·lectivament, aquestes estratègies podrien accelerar l'avanç del desenvolupament i la translació de productes cel·lulars més segurs, efectius i reproduïbles per ser utilitzats en aplicacions clíniques de CRT en HD i potencialment en altres NDs.

[spa] Las enfermedades neurodegenerativas (NDs) se caracterizan por una pérdida selectiva e irreversible de neuronas en áreas específicas del cerebro. Las NDs son incurables y debilitantes, representando la mayor necesidad clínica no satisfecha de nuestro tiempo. La enfermedad o corea de Huntington (HD) es un ejemplo de una devastadora ND, marcada por la degeneración de las neuronas de proyección estriatales (SPNs), que da lugar a síntomas motores, cognitivos y conductuales. Las terapias de reemplazo celular (CRTs) han mostrado un gran potencial para reemplazar neuronas degeneradas en modelos animales y ensayos clínicos para pacientes con enfermedad de Parkinson (PD) y HD. Las CRTs son el único enfoque actualmente dirigido a la restauración estructural y funcional del tejido estriatal atrofiado en HD, mediante la sustitución de la población de SPNs degenerados. En los últimos años, las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) se han convertido en una fuente celular clave para las CRTs debido a la escasez y heterogeneidad de los progenitores neuronales derivados de tejido fetal utilizados previamente. Sin embargo, las hPSCs son propensas a adquirir alteraciones genómicas in vitro, principalmente debido a condiciones de cultivo subóptimas y rutinas inapropiadas para monitorear la integridad del genoma, lo que representa un desafío para la seguridad de las aplicaciones clínicas de las hPSCs y la fiabilidad de la investigación con este tipo celular. Además, la diferenciación de hPSCs hacia tipos neuronales específicos in vitro es un proceso complejo, y la translación clínica de los progenitores neuronales derivados de hPSCs está limitada por la heterogeneidad de los productos celulares obtenidos utilizando los protocolos de diferenciación existentes. Por lo tanto, el desarrollo de CRTs para NDs también requiere la estandarización de los procedimientos de producción para la generación de productos celulares funcionales definidos de manera reproducible, asegurando la presencia de progenitores correctamente especificados hacia el tipo neuronal de interés y la ausencia de tipos celulares no deseados y con fenotipo excesivamente proliferativo. En esta tesis, hemos investigado si la estandarización de las condiciones de cultivo celular y las estrategias de detección genómica podrían disminuir la prevalencia de alteraciones genómicas que afectan a las hPSCs utilizadas como material de partida en estrategias de CRT. Nuestros resultados demuestran que la aplicación de un Sistema de Gestión de Calidad (QMS) como ISO9001:2015 para estandarizar las condiciones de cultivo celular y las rutinas de monitoreo genómico conduce a una notable mejora de la

estabilidad genómica en las hPSCs cultivadas in vitro, evidenciado por una probabilidad reducida de adquisición de aberraciones cromosómicas potencialmente patogénicas y alteraciones genómicas subcromosómicas. También hemos descrito que CD200 es un marcador de superficie celular adecuado para el enriquecimiento de neuroblastos (NBs) estriatales derivados de hPSCs. Hemos desarrollado y optimizado un proceso de selección celular inmunomagnético que permite un enriquecimiento altamente eficiente de NBs estriatales en poblaciones celulares heterogéneas resultantes de la diferenciación in vitro. Nuestros datos demuestran que la implementación de este enfoque lleva a una reducción de la heterogeneidad y de la variabilidad inter-lote de la población celular final. Además, mostramos que las poblaciones celulares aisladas mediante este proceso están compuestas por progenitores especificados correctamente hacia la generación de diferentes subtipos de SPNs, lo que resulta en un mayor rendimiento de neuronas con fenotipo de SPN tras la diferenciación terminal in vitro. También proporcionamos evidencia de que el uso de la selección basada en CD200 en diferentes puntos temporales de la diferenciación in vitro permite la obtención de composiciones celulares enriquecidas en diferentes subtipos de NB estriatales postmitóticos. Finalmente, demostramos que los NBs seleccionados y trasplantados sobreviven tras el transplante intra-estriatal en ratones adultos sin evidencia de sobrecrecimiento del transplante in vivo. En conclusión, nuestros hallazgos enfatizan la necesidad de implementar un QMS en los laboratorios académicos dedicados a la investigación de hPSCs para mejorar la consistencia y seguridad de las aplicaciones de productos celulares derivados hPSCs. Además, nuestros resultados destacan el potencial del enfoque dual de combinar la estandarización de las condiciones de cultivo de hPSCs y la selección celular de NBs estriatales postmitóticos basada en el uso del marcador de superficie CD200 antes del trasplante como una estrategia prometedora para optimizar los resultados de los productos derivados de hPSCs después del trasplante.Colectivamente, estas estrategias podrían acelerar el avance del el desarrollo y la translación de productos celulares más seguros, efectivos y reproducibles para ser utilizados en aplicaciones clínicas de CRT en HD y potencialmente en otras NDs.