Papel de la variabilidad viral, la expresión de RNA y la microbiota en el carcinoma asociado a la infección por el Virus del Papiloma Humano 16

Abstract

[spa] El virus del papiloma humano (VPH) es el agente causal de múltiples cánceres ginecológicos, incluyendo el cáncer de vulva (VSCC). Si bien la infección por VPH es necesaria para el desarrollo de estas neoplasias, no es suficiente por sí sola. Otros factores, tanto virales como del huésped, juegan un papel crucial en la progresión de las lesiones precancerosas a cáncer invasivo. Este proyecto de doctorado se centró en la identificación de factores moleculares que determinan la progresión a cáncer de lesiones de alto grado (HSIL) asociadas a la infección por VPH en la vulva. Para ello, se utilizaron dos aproximaciones: el análisis de perfiles de expresión de mRNAs y microRNAs en muestras de vulva, y el análisis de la composición de la microbiota en muestras cervicovaginales. Se identificaron 14 genes (CASC15, CCNA1, APOBEC3A, CDKN2A, ASCL1, KRT17, MMP9, APOC1, PRL, SOX2, ITGA8, CALML5, KLF4, ESR1, SLIT2, CASZ1, AR) y 15 microRNAs (miR-4286, miR-223-3p, miR-206, miR-575, miR- 494-3p, miR-630, miR-642a-3p, miR-1973, miR-31-5p, miR-99a-5p, let-7c-5p, miR-143-3p, miR-451a, miR-125b-5p, miR-145-5p) diferencialmente expresados entre muestras HSIL y VSCC positivas a VPH16, -18, 33 y también negativas a VPH. Además, se identificaron los genes IFNG, IRF4, PD-L1, HOXA1 e IFNA2, implicados en la regulación de la respuesta inmune, específicamente desregulados en las muestras positivas a VPH16. Los análisis de expresión de mRNAs y microRNAs revelaron que las principales vías y funciones biológicas alteradas entre HSIL y VSCC son la regulación del ciclo celular, la respuesta inmune, la migración e invasión tumoral, la familia APOBEC3 y las hormonas y receptores sexuales. En el análisis de la microbiota cervicovaginal, se desarrolló un protocolo para analizar la composición de la microbiota en muestras clínicas mediante secuenciación del gen 16S rRNA utilizando la tecnología de Oxford Nanopore.

El protocolo desarrollado se validó en un conjunto de muestras pareadas de 14 pacientes (8 positivas y 6 negativas a VPH) participantes en un estudio de aceptabilidad de la autotoma como método de muestreo en el programa de cribado de cáncer cervical. De cada paciente se obtuvo una citología líquida tomada por el profesional y una automuestra tomada por la propia paciente. Al comparar entre pacientes positivas y negativas a VPH, se observó una disminución en la abundancia relativa de Lactobacillus y un aumento en la diversidad bacteriana en las muestras positivas a VPH. Los géneros Atopibium, Megasphera, Parvimonas, Peptoniphilus, Mageeibacillus, Dialister y Sneathia resultaron significativamente más abundantes en las muestras positivas a VPH. Por su parte, el automuestreo se validó como un método equivalente a la citología líquida para la evaluación de la microbiota cervicovaginal, no observándose diferencias significativas en la composición de la microbiota cervicovaginal en ningún caso.

[eng] Human papillomavirus (HPV) is the causal agent of multiple gynecological cancers, including vulvar squamous cell carcinoma (VSCC). While HPV infection is necessary for the development of lesions, it is not sufficient on its own. Other factors, both viral and host-related, play a crucial role in the progression of precancerous lesions to invasive cancer. This PhD project focused on identifying molecular factors that determine the progression to VSCC from high-grade squamous intraepithelial lesions (HSILs) associated with HPV infection. Two approaches were used: analysis of mRNA and microRNA expression profiles in vulvar samples, and analysis of the microbiota composition in cervicovaginal samples. Seventeen (CASC15, CCNA1, APOBEC3A, CDKN2A, ASCL1, KRT17, MMP9, APOC1, PRL, SOX2, ITGA8, CALML5, KLF4, ESR1, SLIT2, CASZ1, AR) genes and fifteen microRNAs (miR-4286, miR-223-3p, miR-206, miR-575, miR-494-3p, miR-630, miR-642a-3p, miR-1973, miR-31-5p, miR-99a-5p, let-7c-5p, miR-143- 3p, miR-451a, miR-125b-5p, miR-145-5p) were identified as differentially expressed between HSIL and VSCC samples positive for HPV16, -18, 33, and also HPV-negative samples. Additionally, the genes IFNG, IRF4, PD-L1, HOXA1, and IFNA2, involved in immune response regulation, were specifically dysregulated in HPV16-positive samples. The altered pathways and biological functions between HSIL and VSCC included cell cycle regulation, immune response, tumor migration and invasion, the APOBEC3 family, and sexual hormones and receptors. In the analysis of the cervicovaginal microbiota, a protocol was developed to analyze microbiota composition in clinical samples by sequencing the 16S rRNA gene using Oxford Nanopore technology. A decrease in the abundance of Lactobacillus and an increase in bacterial diversity were observed in HPV- positive samples.

Self-sampling was validated as an equivalent method to liquid-based cytology for evaluating the cervicovaginal microbiota in clinical samples from cervical cancer screening programmes.