Characterization and prospective applications of melanin from black fungi in environmental biotechnology

Abstract

[eng] Black fungi comprise a diverse group of ascomycetes characterized by their dark pigmentation due to the presence of melanin within their cells. This melanization process confers black fungi with a remarkable adaptability to a broad spectrum of harsh environments, including extreme temperatures, pH, water activity, and pressure values, as well as high levels of UV/ionizing radiation, and exposure to toxic chemicals. Over the past decade, fungal melanin has garnered increasing interest for its potential applications in organic semiconductors and bioelectronics, drug delivery systems, photoprotective materials, and environmental remediation processes. Despite significant advancements in these fields, the large-scale industrial application remains limited. Primarily due to the restricted availability and high cost associated with synthetic melanin production. Furthermore, the complex physicochemical properties of melanin, coupled with its low solubility in water and organic solvents, hamper both its study and practical utilization. This thesis investigated the metallotolerance of a collection of 34 strains of black fungi isolated from hydrocarbon-rich environments. Two metallotolerant strains belonging to Exophiala mesophila and Rhinocladiella similis were selected for subsequent biosorption experiments on As(V) and Cr(VI), as respective models of environmentally relevant metalloid and a heavy metal. The sorption efficacy of E. mesophila melanin extracts was studied in more detail and the sorption isotherm and kinetics were determined for Cr(VI). The results revealed high inter- and intraspecific variability in metallotolerance, suggesting the existence of additional physiological mechanisms beyond melanization that enable these fungi to cope with the toxic effects of metals and metalloids. A significant difference in the maximum Cr(VI) adsorption capacity (qmax) was observed between alive fungal biomass, dead biomass, and he fungal melanin extracts (alive biomass and extracted melanin, qmax: 95.26 vs. 544.84 mgCr6+ g⁻¹). A protocol for the production of E mesophila biomass and for the optimized extraction of melanin was developed to obtain sufficient yields of this biomaterial for subsequent fundamental and applied research. Fungal melanin was then characterized by using an array of spectrophotometric techniques (UV-Vis, FTIR, and EPR) and by cyclic voltammetry (CV). The utilization of tricyclazole, a specific inhibitor of the biosynthesis of the melanin type most black fungi have been associated to (built from 1,8-dihydroxynaphthalene monomers), allowed us to identify, OH, COOH and C=O as the primary groups involved in Cr(VI) binding mechanisms during adsorption processes by whole cells of E. mesophila. Additionally, bioelectrochemical assessment of melanin revealed electrochemical properties as semiconductor, as well as a synergistic electroactive interaction with Geobacter sulfarreduscens. Cyclic voltammetry of melanin extracts incubated with and without cell suspensions of the electroconductive bacterium Geobacter sulfurreducens were indicative of novel semiquinone/hydroquinone redox transformations. This melanin interactions may play an important role in cation exchange for the adsorption of metals and in microbial interspecies electron transfer processes, which were intrinsically linked to quinone and semiquinone moietieslecules in the melanin. The mechanisms of metallotolerance of E. mesophila to As(V) and Cr(VI) exposure were studied by combining high throughput biochemical and transcriptome analyses. FTIR analyses revealed changes particularly affecting the content of amide I and II bands (proteins), phospholipids (associated with membranes and DNA), and lipids.

The main upregulated metabolic pathways associated to metallotolerance included the enhanced expression of genes related to protective and transport mechanisms, such as cassette ABC transporters, vacuolar transport, NADPH-dependent Cr(VI) reduction and storage, and antioxidant enzymes (SOD and CAT) to mitigate reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, we identified upregulation of various DNA repair pathways and protein synthesis. Novel applications of fungal melanin, aimed at mitigating the emissions of greenhouse gases were investigated. Melanin extracts from E. mesophila were compared with other (semi) conductor materials (biochar and magnetite) to assess its influence on carbon cycling and cumulative methane emissions in anaerobic microcosms with soil from postharvest rice fields, amended with rice straw mimicking the postharvest season, when significant amounts of methane are emitted in rice paddy fields. Individual melanin and biochar amendments resulted in a significant reduction of cumulative methane emission (29% and 10% of depletion, respectively (p < 0.0001), compared to the control without conductive materials) after 130 days of incubation. This reduction could be attributed to the potential of fungal melanin and biochar to stimulate direct interspecies electron transfer (DIET) mechanism in anoxic soils. Upon melanin application, linear discriminant analysis effect size (LEfSe) revealed a differential and significant presence of putative electroactive bacteria belonging to the genera Geobacter and Pseudopelobacter,as well as methanogenic archaea (Methanosarcinia), which could be outcompeted by the DIET mechanisms of other methanogenic populations with higher methane generation rates in the absence of melanin and biochar. The observed effect suggests that melanin may shorten the lag phase for methane production but ultimatelly lead to a lower overall emission rate. Compound specific isotope analysis of the emitted methane and carbon dioxyde (δ13C-CH4, δ13C-CO2 and δ2H-CH4) revealed that the main methanogenic pathway in the melanin/biochar amended microcosms proceeded through methylotrophic/acetotrophic archaea, instead of hydrogenotrophic pathway predominant in all soil microcosms.

[spa] Los hongos negros (Black fungi) constituyen un grupo diverso de ascomicetos caracterizados por su pigmentación oscura debido a la presencia de melanina dentro de sus células. Este proceso de melanización confiere a los hongos negros una notable adaptabilidad a un amplio espectro de ambientes hostiles, incluyendo temperaturas extremas, pH, actividad del agua y valores de presión, así como altos niveles de radiación UV/ionizante y exposición a productos químicos tóxicos. En la última década, la melanina fúngica ha despertado un creciente interés por sus potenciales aplicaciones en semiconductores orgánicos y bioelectrónica, sistemas de administración de fármacos, materiales fotoprotectores y procesos de biorremediación ambiental. A pesar de los avances significativos en estos campos, la aplicación industrial a gran escala sigue siendo limitada. Esto se debe principalmente a la disponibilidad restringida y al alto costo asociado con la producción de melanina sintética. Además, las complejas propiedades fisicoquímicas de la melanina, junto con su baja solubilidad en agua y solventes orgánicos, dificultan tanto su estudio como su uso práctico. Aquí está la versión reescrita en castellano científico: Esta tesis investigó la metalotolerancia de una colección de 34 cepas de hongos negros aisladas de ambientes ricos en hidrocarburos. Se seleccionaron dos cepas metalotolerantes pertenecientes a Exophiala mesophila y Rhinocladiella similis para posteriores experimentos de biosorción sobre As(V) y Cr(VI), como modelos representativos de un metaloide y un metal pesado ambientalmente relevantes. La eficacia de sorción de los extractos de melanina de E. mesophila se estudió con mayor detalle, determinándose la isoterma y la cinética de sorción para Cr(VI). Los resultados revelaron una alta variabilidad inter e intraespecífica en la metalotolerancia, lo que sugiere la existencia de mecanismos fisiológicos adicionales a la melanización que permiten a estos hongos afrontar los efectos tóxicos de metales y metaloides. Se observó una diferencia significativa en la capacidad máxima de adsorción de Cr(VI) (qmax) entre la biomasa fúngica viva, la biomasa muerta y los extractos de melanina fúngica (biomasa viva y melanina extraída, qmax: 95.26 vs. 544.84 mg Cr6+ g⁻¹). Se desarrolló un protocolo para la producción de biomasa de Exophiala mesophila y la extracción optimizada de melanina con el objetivo de obtener rendimientos suficientes de este biomaterial para posteriores estudios fundamentales y aplicados. La melanina fúngica se caracterizó mediante un conjunto de técnicas espectrofotométricas (UV-Vis, FTIR y EPR) y voltamperometría cíclica (CV). La utilización de triciclazol, un inhibidor específico de la biosíntesis del tipo de melanina que se ha asociado a la mayoría de los hongos negros (construida a partir de monómeros de 1,8-dihidroxinaftaleno), permitió identificar a los grupos OH, COOH y C=O como los principales implicados en los mecanismos de unión de Cr(VI) durante los procesos de adsorción por células enteras de E. mesophila. Además, la evaluación bioelectroquímica de la melanina reveló propiedades electroquímicas de semiconductor, así como una interacción sinérgica electroactiva con Geobacter sulfurreducens. La voltamperometría cíclica de extractos de melanina incubados con y sin suspensiones celulares de la bacteria electroconductora Geobacter sulfurreducens indicó la existencia de novedosas transformaciones redox de semiquinona/hidroquinona. Estas interacciones de la melanina podrían desempeñar un papel

importante en el intercambio catiónico para la adsorción de metales y en los procesos de transferencia electrónica interespecies microbianos, los cuales están intrínsecamente relacionados con las moléculas de grupos quinona y semiquinona presentes en la melanina. Los mecanismos de metalotolerancia de Exophiala mesophila frente a la exposición a As(V) y Cr(VI) se estudiaron mediante la combinación de análisis bioquímicos y transcriptómicos de alto rendimiento. Los análisis de espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR) revelaron cambios que afectaban particularmente al contenido de las bandas de amida I y II (proteínas), fosfolípidos (asociados a membranas y ADN) y lípidos. Las principales rutas metabólicas reguladas al alza y asociadas a la metalotolerancia incluyeron una mayor expresión de genes relacionados con mecanismos de protección y transporte, como transportadores ABC de casete, transporte vacuolar, reducción y almacenamiento de Cr(VI) dependiente de NADPH y enzimas antioxidantes (SOD y CAT) para mitigar la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS). Además, se identificó la regulación positiva de diversas rutas de reparación del ADN y la síntesis de proteínas. Se investigaron novedosas aplicaciones de la melanina fúngica dirigidas a mitigar las emisiones de gases de efecto invernadero. Se compararon extractos de melanina de E. mesophila con otros materiales (semi)conductores (biochar y magnetita) para evaluar su influencia en el ciclo del carbono y las emisiones acumuladas de metano en microcosmos anaeróbicos con suelo de arrozales postcosecha. Se agregó paja de arroz para simular la estación postcosecha, cuando se emiten cantidades significativas de metano en los arrozales. Las enmiendas individuales de melanina y biocarbón dieron lugar a una reducción significativa de la emisión acumulada de metano (29% y 10% de disminución, respectivamente (p < 0,0001), en comparación con el control sin materiales conductores) después de 130 días de incubación. Esta reducción podría atribuirse al potencial de la melanina fúngica y el biochar para estimular el mecanismo de transferencia directa de electrones entre especies (DIET) en suelos anóxicos. Tras la aplicación de melanina, el análisis del efecto del tamaño (LEfSe) mediante análisis discriminante lineal reveló una presencia diferencial y significativa de bacterias putativamente electroactivas pertenecientes a los géneros Geobacter y Pseudopelobacter, así como arqueas metanogénicas (Methanosarcinia). Estas poblaciones podrían ser superadas por los mecanismos DIET de otras poblaciones metanogénicas con mayores tasas de generación de metano en ausencia de melanina y biochar. El efecto observado sugiere que la melanina puede acortar la fase de latencia para la producción de metano, pero en última instancia, conducir a una tasa de emisión global más baja. El análisis de isótopos específicos de los compuestos del metano y dióxido de carbono emitidos (δ13C-CH4, δ13C-CO2 y δ2H-CH4) reveló que la principal ruta metanogénica en los microcosmos modificados con melanina/biochar procedía de arqueas metilotróficas/acetotróficas, en lugar de la ruta hidrogenotrófica predominante en todos los microcosmos del suelo.