Optimización del diagnóstico parasitológico de la leishmaniosis tegumentaria y caracterización de especie/s de Leishmania causantes del cuadro clínico en Cochabamba (Bolivia)

Abstract

[spa] En Bolivia, la leishmaniosis tegumentaria (LT) abarca siete de los nueve departamentos, siendo uno de los países que presenta un mayor número de casos de leishmaniosis mucosa (LM) o leishmaniosis mucocutánea (LMC). Debido a que existen enfermedades tropicales de otra etiología, que presentan una clínica similar, y a la toxicidad, elevado coste y escasa disponibilidad de los fármacos utilizados en el tratamiento, es necesario la confirmación de la enfermedad por técnicas de laboratorio. El diagnóstico de la leishmaniosis, se realiza por examen parasitológico directo (EPD) y cultivo, siendo el primero el más utilizados en laboratorios de baja complejidad, mientras que el cultivo se realiza en laboratorios de referencia. La caracterización de especies de Leishmania en el país se realiza en forma esporádica y solo con fines epidemiológicos o de investigación y la técnica utilizada es la PCR-RFLP. Dicha caracterización permitiría realizar el pronóstico de la enfermedad, mejorar su seguimiento y actualizar la distribución epidemiológica de las cepas que circulan en Bolivia. El objetivo general del presente trabajo es optimizar el diagnóstico parasitológico de la LT y caracterizar la/s especie/s de Leishmania causante/s del cuadro clínico en pacientes que asisten al Laboratorio de Parasitología de la Facultad de Medicina de la UMSS en Cochabamba, Bolivia. La caracterización se ha realizado mediante secuenciación del fragmento de 1245 pb del gen hsp70 y el MALDI-TOF MS, analizándose 55 cepas aisladas de 44 pacientes. Se identificaron 44 cepas del complejo L. braziliensis, dos cepas de L. lainsoni, una cepa de L. guyanensis y ocho cepas del complejo L. mexicana. La caracterización por secuanciación del complejo L. braziliensis reveló la presencia de L. braziliensis s. str., L. peruviana, una tercera posible especie, L. braziliensis outlier, y dos posibles híbridos de L. braziliensis/L. peruviana. MALDI-TOF, ha caracterizado de forma correcta todas las cepas de Leishmania a nivel de género, subgénero y complejo y el 81,8% a nivel de especie. Las cepas mal identificadas correspondieron a una cepa de L. peruviana, identificada como L. braziliensis s.str., dos híbridos L. braziliensis/L. peruviana, identificadas como L. braziliensis, dos L. mexicana, identificadas como L. amazonensis, y cinco híbridos de L. mexicana/L. amazonensis identificadas como L. amazonensis (2) y L. garnhami (3). Tan sólo una de las cepas del complejo L. mexicana fue correctamente identificada como L. amazonensis. Si se eliminan los híbridos, se incrementa el rendimiento del MALDI-TOF al 93,5%, por lo que, debido a su rapidez en la obtención de resultados, su simplicidad, el menor coste para la identificación de aislamientos de Leishmania, una vez obtenido el cultivo, y su facilidad de integrarse a un laboratorio clínico, podría constituirse como una estrategia de caracterización de especies de Leishmania en países endémicos donde aún no se tienen implementada la caracterización molecular. El complejo L. braziliensis ha presentado una gran diversidad genética por secuenciación, caracterizándose nueve genotipos diferentes de L. braziliensis outlier en 16 cepas analizadas en relación a L. braziliensis (6 genotipos en 24 cepas) y L. peruviana (1 genotipo en 1 cepa), característica que la posiciona a mayor distancia genética de L. braziliensis y L. peruviana. Es la primera vez que se aisla L. peruviana en Bolivia, en un paciente con LM y con falla terapéutica (FT). También se ha aislado L. braziliensis s. str. de LM en ocho pacientes, dos de éstos con FT, y L. braziliensis outlier de un paciente, ninguno con FT. La evaluación de las técnicas parasitológicas (EPD, cultivo en TSTB, minicultivo y microcultivo en medio Schneider) utilizando dos tipos de muestras (aspirado: 121 y raspado: 121), ha permitido demostrar que el raspado de los bordes de la lesión es más sensible (78%) que el aspirado (71%) para el diagnóstico de LT, independientemente de la técnica utilizada. El porcentaje de positividad en los cultivos, aumenta con el tiempo de cultivo, independientemente del método utilizad hasta el día 28, lo que sugiere que los cultivos deben mantenerse durante este tiempo. A pesar de observarse contaminación bacteriana, por levaduras y hongos filamentosos en un 37% de los cultivos, se observó crecimiento de las leishmanias en un 17% de los medios contaminados. Si bien el EPD puede seguir utilizándose en el diagnóstico de la LT dada la simplicidad en su ejecución, la seguridad para el personal de laboratorio y el menor traumatismo para el paciente, se recomienda la implementación del cultivo en TSTBS en el diagnóstico de la LT por su sensibilidad (98%), buena correlación con el estándar de diagnóstico (k-Cohen 0,88) y coeficiente de fiabilidad satisfactorio (α-Cronbach ≥0,91), siendo necesario capacitar al personal de los laboratorios de segundo y tercer nivel en Bolivia para su implementación.

[eng] In Bolivia, tegumentary leishmaniasis (TL) covers seven of the nine departments, being one of the countries with the highest number of cases of mucosal leishmaniasis (ML) or mucocutaneous leishmaniasis (MCL). Because there are tropical diseases of other etiologies, which present similar symptoms, and due to the toxicity, high cost and limited availability of the drugs used in the treatment, confirmation of the disease by laboratory techniques is necessary. The diagnosis of leishmaniasis is made by direct parasitological examination (DPE) and culture, the first being the most used in low complexity laboratories while the culture is performed in a reference laboratories. The characterization of Leishmania species in the country is carried out sporadically and only for epidemiological or research purposes and the technique used is PCR-RFLP. Such characterization would allow for the prognosis of the disease, improving its monitoring and updating the epidemiological distribution of the strains circulating in Bolivia. The general objective of the present work is to optimize the parasitological diagnosis of TL and characterize the Leishmania species(s) causing the clinical picture in patients attending the Parasitology Laboratory of the Faculty of Medicine of the UMSS in Cochabamba, Bolivia. The characterization was carried out by sequencing the 1245 bp fragment of the hsp70 gene and MALDI-TOF MS, analyzing 55 strains isolated from 44 patients. 44 strains of the L. braziliensis complex, two strains of L. lainsoni (2), one strain of L. guyanensis and eight strains of the L. mexicana complex were identified. Characterization by sequencing of the L. braziliensis complex revealed the presence of L. braziliensis s. str., L. peruviana, a third possible species, L. braziliensis outlier, and two possible hybrids of L. braziliensis/L. peruviana. MALDI-TOF has correctly characterized all Leishmania strains at the genus, subgenus and complex level and 81.8% at the species level. The misidentified strains corresponded to one L. peruviana strain, identified as L. braziliensis s.str., two L. braziliensis/L. peruviana, identified as L. braziliensis, two L. mexicana, identified as L. amazonensis, and five hybrids of L. mexicana/L. amazonensis, identified as L. amazonensis (2) and L. garnhami (3). Only one of the strains of the L. mexicana complex was correctly identified as L. amazonensis. If the hybrids are eliminated, the performance of MALDI-TOF increases to 93.5%, therefore, due to its speed in obtaining results, its simplicity, the lower cost for the identification of Leishmania isolates, once the culture obtained, and its ease of integration into a clinical laboratory, could be constituted as a strategy for characterization of Leishmania species in endemic countries where molecular characterization has not yet been implemented. The L. braziliensis complex has presented great genetic diversity by sequencing, characterizing nine different genotypes of L. braziliensis outlier in 16 strains analyzed in relation to L. braziliensis (6 genotypes in 24 strains) and L. peruviana (1 genotype in 1 strain), a characteristic that positions it at greater genetic distance from L. braziliensis and L. peruviana. This is the first time that L. peruviana has been isolated in Bolivia, in a patient with ML and therapeutic failure (TF). L. braziliensis s.str. has also been isolated of ML in eight patients, two of them with TF, and L. braziliensis outlier in one patient, none of them with TF. The evaluation of parasitological techniques (DPE, culture in TSTB, miniculture and microculture in Schneider medium) using two types of samples (aspirate: 121 and scraping: 121), has allowed us to demonstrate that scraping the edges of the lesion is more sensitive (78%) than aspirate (71%) for the diagnosis of TL, regardless of the technique used. The percentage of positivity in cultures increases with culture time, regardless of the method used until day 28, which suggests that cultures should be maintained during this time. Despite bacterial contamination, yeasts and filamentous fungi being observed in 37% of the cultures, leishmania growth was observed in 17% of the contaminated media. Although the DPE can continue to be used in the diagnosis of TL, given the simplicity in its execution, the safety for laboratory personnel and the lesser trauma for the patient, the implementation of culture in TSTBS is recommended in the diagnosis of TL by its sensitivity (98%), good correlation with the diagnostic standard (k-Cohen 0.88) and satisfactory reliability coefficient (α-Cronbach ≥0.91), making it necessary to train the personnel of the second and third level laboratories in Bolivia for its implementation.

[fra] En Bolivie, la leishmaniose tégumentaire (LT) couvre sept des neuf départements, étant l'un des pays avec le plus grand nombre de cas de leishmaniose muqueuse (LM) ou de leishmaniose cutanéo-muqueuse (LCM). Étant donné qu'il existe des maladies tropicales d'autres étiologies, qui présentent des symptômes similaires, et en raison de la toxicité, du coût élevé et de la disponibilité limitée des médicaments utilisés pour le traitement, la confirmation de la maladie par des techniques de laboratoire est nécessaire. Le diagnostic de la leishmaniose se fait par examen parasitologique direct (EPD) et culture, le premier étant le plus utilisé dans les laboratoires de faible complexité tandis que la culture est réalisée dans laboratoires de référence. La caractérisation des espèces de Leishmania dans le pays est réalisée de manière sporadique et uniquement à des fins épidémiologiques ou de recherche et la technique utilisée est la PCR-RFLP. Une telle caractérisation permettrait d'établir le pronostic de la maladie, d'améliorer sa surveillance et d'actualiser la répartition épidémiologique des souches circulant en Bolivie. L'objectif général du présent travail est d'optimiser le diagnostic parasitologique de la LT et de caractériser la ou les espèces de Leishmania provoquant le tableau clinique chez les patients fréquentant le Laboratoire de Parasitologie de la Faculté de Médecine de l'UMSS de Cochabamba, Bolivie. La caractérisation a été réalisée par séquençage du fragment de 1245 pb du gène hsp70 et MALDI-TOF MS, en analysant 55 souches isolées de 44 patients. 44 souches du complexe L. braziliensis, deux souches de L. lainsoni, une souche de L. guyanensis et huit souches du complexe L. mexicana ont été identifiées. La caractérisation par séquençage du complexe L. braziliensis a révélé la présence de L. braziliensis s. str., L. peruviana, une troisième espèce possible, L. braziliensis atypique et deux hybrides possibles de L. braziliensis/L. peruviana. MALDI-TOF MS a correctement caractérisé toutes les souches de Leishmania au niveau du genre, du sous-genre et du complexe et 81,8 % au niveau de l'espèce. Les souches mal identifiées correspondaient à une souche de L. peruviana, identifiée comme L. braziliensis s.str., deux L. braziliensis/L. peruviana, identifiées comme L. braziliensis, deux L. mexicana, identifiées comme L. amazonensis, et cinc hybrides L. mexicana/L. amazonensis identifiés comme L. amazonensis (2) et L. garnhami (3). Seule une des souches du complexe L. mexicana a été correctement identifiée comme étant L. amazonensis. Si les hybrides sont éliminés, la performance de MALDI-TOF augmente à 93,5%, donc, en raison de sa rapidité d'obtention des résultats, de sa simplicité, du moindre coût pour l'identification des isolats de Leishmania, une fois la culture obtenue, et de sa facilité d'intégration en laboratoire clinique, pourrait constituer une stratégie de caractérisation des espèces de Leishmania dans les pays endémiques où la caractérisation moléculaire n'a pas encore été mise en œuvre. Le complexe L. braziliensis a présenté une grande diversité génétique par séquençage, caractérisant neuf génotypes différents de L. braziliensis atypique dans 16 souches analysées en relation avec L. braziliensis (6 génotypes dans 24 souches) et L. peruviana (1 génotype dans 1 souche), une caractéristique qui la positionne à une plus grande distance génétique de L. braziliensis et L. peruviana. C'est la première fois que L. peruviana est isolée en Bolivie, chez un patient atteint de LM et d'échec thérapeutique (ET). L. braziliensis s.str. a également été isolée de LM chez 8 patients, dont deux avec ET, et de L. braziliensis atypique chez un patient, aucun d'entre eux avec ET. L'évaluation des techniques parasitologiques (EPD, culture en TSTB, miniculture et microculture en milieu Schneider) utilisant deux types d'échantillons (aspiration : 121 et grattage : 121), a permis de démontrer que le grattage des bords de la lésion est plus sensible (78%) que l’aspiration (71%) pour le diagnostic de la LT, quelle que soit la technique utilisée. Le pourcentage de positivité dans les cultures augmente avec la durée de la culture, quelle que soit la méthode utilisée, jusqu'au jour 28, ce qui suggère que les cultures doivent être maintenues pendant cette période. Malgré une contamination bactérienne, des levures et des champignons filamenteux étant observés dans 37% des cultures, une croissance des leishmanies a été observée dans 17% des milieux contaminés. Bien que l'EPD puisse continuer à être utilisé dans le diagnostic de la LT compte tenu de la simplicité de son exécution, de la sécurité du personnel de laboratoire et du moindre traumatisme pour le patient, la mise en œuvre de la culture en TSTBS est recommandée dans le diagnostic de la LT par sa sensibilité (98%), bonne corrélation avec la standard de diagnostic (k-Cohen 0,88) et le coefficient de fiabilité satisfaisant (α-Cronbach ≥0,91), rendant nécessaire la formation du personnel des laboratoires de deuxième et troisième niveaux en Bolivie pour sa mise en œuvre.