Targeting the TGF-ß pathway, SMAD proteins and cofactors

Abstract

[eng] TGF-ꞵ signaling is key for many biological processes as embryo development, tissue homeostasis and immune system regulation. When altered, this pathway can lead to diseases such as cancer, fibrosis and rare syndromes. Key elements of the pathway are the SMAD family of transcription factors, which translate the extracellular signal received by the TGF-ꞵ receptor to the nucleus for regulation of gene expression. SMAD proteins have a characteristic structure which is shaped by an MH1 domain, for specific DNA recognition, a flexible linker region, and their MH2 domain, which can form complexes with other SMAD proteins and co-factors. This last domain is often mutated in disease, especially in the case of SMAD4 for which single point mutations and deletions have been identified in the literature. In this work, I focused on the study of SMAD4 variants associated with diseases, such as cancer, Juvenile Polyposis Syndrome, Hemorrhagic Hereditary Telangiectasia and Myhre Syndrome. With this aim, we produced different recombinant protein constructs to study the effect of these variants in their fold and binding properties. Firstly, I started with the characterization of the variants R496C- and I500V/M/T- SMAD4, associated with Myhre Syndrome. This is a gain-of-function disease that begins during embryonic development, and the alterations observed lead to the dysfunction of multiple organs. We could confirm that these specific SMAD4 variants had increased levels of SMAD4 protein in cells, possibly related to decreased ubiquitination and degradation of the protein, among other possible causes are loss-of-function variants, as in gastrointestinal cancers and Juvenile Polyposis. In this case, our work showed that the complexes with R-SMADs and the variants lead to several different stoichiometries compared to those of the wild type (WT) protein. The second section of this thesis is focused on the search for small-molecules as SMAD4 binders. We used single molecule biophysics and structural biology to identify pharmacological strategies based on targeting SMAD4 to modulate TGF-ꞵ signaling. This search was conducted through a target-based in vitro approach using purified SMAD4 MH2 domain and large libraries of compounds. Among these compounds, we included FDA-approved drugs in case we could identify hits that could be repurposed to treat individuals suffering from very rare syndromes. Validated hits have affinities of interaction ranging between low and high micromolar and will be further developed and tested. Some interesting. approved drugs were identified as SMAD4 binders. In the last chapter of this project, I focused on the DNA recognition ability of Ras Responsive Element Binder 1 (RREB1). RREB1 plays a key role in communication between RAS and TGF-ꞵ signaling to regulate epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) during embryonic development and maintenance of healthy tissue, but also during cancer progression. RREB1 is a zinc finger (ZF) protein with multiple isoforms. In particular, I studied a well-conserved evolutionary ZF pair located at the C-terminus of the protein.

[cat] La senyalització TGF-ꞵ és clau per a molts processos biològics com el desenvolupament embrionari, l'homeòstasi tissular i la regulació del sistema immunitari. Quan s'altera, aquesta via pot provocar malalties com el càncer, la fibrosi i les síndromes rares. Els elements clau de la via són la família de factors de transcripció SMAD, que tradueixen el senyal extracel·lular rebut pel receptor TGF-ꞵ al nucli per a la regulació de l'expressió gènica. Les proteïnes SMAD tenen una estructura característica que està formada per un domini MH1, per al reconeixement específic de l'ADN, una regió d'enllaç flexible i el seu domini MH2, que pot formar complexos amb altres proteïnes SMAD i cofactors. Aquest últim domini sovint està mutat en la malaltia, especialment en el cas de SMAD4 per al qual s'han identificat mutacions i delecions puntuals en la literatura. En aquest treball, em vaig centrar en l'estudi de les variants de SMAD4 associades a malalties, com el càncer, la síndrome de poliposi juvenil, la telangièctasis hereditària hemorràgica i la síndrome de Myhre. Amb aquest objectiu, hem produït diferents construccions de proteïnes recombinants per estudiar l'efecte d'aquestes variants en les seves propietats de plegament i unió. En primer lloc, vaig començar amb la caracterització de les variants R496C- i I500V/M/T- SMAD4, associades a la síndrome de Myhre. Es tracta d'una malaltia de guany de funció que comença durant el desenvolupament embrionari, i les alteracions observades condueixen a la disfunció de múltiples òrgans. Vam poder confirmar que aquestes variants específiques de SMAD4 tenien nivells elevats de proteïna SMAD4 a les cèl·lules, possiblement relacionats amb la disminució de la ubiquitinació i la degradació de la proteïna, entre altres possibles causes són les variants de pèrdua de funció, com en els càncers gastrointestinals i la poliposi juvenil. En aquest cas, el nostre treball va mostrar que els complexos amb R-SMAD i les variants condueixen a diverses estequiometries diferents en comparació amb les de la proteïna de tipus salvatge (WT). La segona secció d'aquesta tesi se centra en la recerca de molècules petites com a aglutinants SMAD4. Vam utilitzar la biofísica d'una sola molècula i la biologia estructural per identificar estratègies farmacològiques basades en l'orientació de SMAD4 per modular la senyalització TGF-ꞵ. Aquesta recerca es va dur a terme mitjançant un enfocament in vitro basat en objectius utilitzant el domini SMAD4 MH2 purificat i grans biblioteques de compostos. Entre aquests compostos, vam incloure fàrmacs aprovats per la FDA per si poguéssim identificar èxits que es podrien reutilitzar per tractar persones que pateixen síndromes molt rares. Els hits validats tenen afinitats d'interacció entre micromolars baixos i alts i es desenvoluparan i provaran més a més. Alguns interessants. els medicaments aprovats es van identificar com a aglutinants SMAD4. En l'últim capítol d'aquest projecte, em vaig centrar en la capacitat de reconeixement d'ADN de Ras Responsive Element Binder 1 (RREB1). RREB1 té un paper clau en la comunicació entre la senyalització RAS i TGF-ꞵ per regular la transició epitelial a mesenquimal (EMT) durant el desenvolupament embrionari i el manteniment del teixit sa, però també durant la progressió del càncer. RREB1 és una proteïna de dit de zinc (ZF) amb múltiples isoformes. En particular, vaig estudiar un parell ZF evolutiu ben conservat situat al C-terminal de la proteïna.