Desarrollo de estrategias analíticas avanzadas para la caracterización de las proteínas de quinoa. Aplicación en variedades, tipos de producción agrícola y tecnologías de procesamiento

Abstract

[spa] La quinoa, un grano originario de los Andes, se considera uno de los alimentos más prometedores para combatir la inseguridad alimentaria, ya que no solo destaca por su perfil nutricional excepcional, sino también por su capacidad para desarrollarse en condiciones ambientales adversas. Estas cualidades han facilitado su introducción y cultivo en diversas regiones del mundo, expandiendo su comercialización. Sin embargo, el creciente interés en su consumo ha generado casos de adulteración de la harina de quinoa con cereales más baratos, lo que ha provocado una gran preocupación en los organismos responsables de garantizar la calidad, seguridad y autenticidad alimentaria. Además, la limitada investigación sobre el perfil proteico de la quinoa, tanto en la producción agrícola como en la industria alimentaria, está también impulsando a la comunidad científica a desarrollar metodologías analíticas avanzadas para abordar estos desafíos.

Por ello, en esta tesis doctoral se desarrollaron metodologías de análisis no dirigido para la separación, identificación, caracterización y cuantificación de las proteínas presentes en diferentes tipos de muestras de quinoa. Estas metodologías se establecieron después de optimizar un procedimiento para la preparación de los extractos proteicos, estudiando las cuatro variedades comerciales de granos de quinoa más comunes, que incluyen la quinoa negra (B), roja (R), blanca de Perú (W) y blanca de Bolivia (RO), también conocida como quinoa real. Los métodos analíticos más sencillos se basaron en técnicas de separación de alta resolución, como la electroforesis capilar con detección espectrofotométrica (CE- UV) y la cromatografía de líquidos con detección espectrofotométrica (LC-UV), con el fin de emplear los perfiles proteicos globales de los granos de quinoa a modo de improntas características de las proteínas más abundantes. Además, se utilizaron técnicas basadas en espectrometría de masas (MS), incluyendo la cromatografía de líquidos acoplada a la espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para el análisis bottom-up de los perfiles proteómicos de la quinoa, y la espectrometría de masas con ionización por desorción láser asistida por una matriz y analizador de tiempo de vuelo (MALDI-TOF- MS) para el análisis de proteínas intactas en los mismos granos, donde se pudo identificar tentativamente las proteínas a partir del mapa proteómico previamente establecido. Por otro lado, también se estableció una estrategia de análisis de datos (data mining) de los mapas proteómicos obtenidos por LC-MS/MS para la identificación de proteínas con potenciales propiedades

inmunonutricionales, proporcionando una visión más profunda de proteínas específicas que por su bioactividad podrían ser de gran importancia para el fortalecimiento de la salud y la calidad de vida. Para la interpretación de los datos generados en estos estudios, a la búsqueda de clases de muestras, muestras anómalas y los componentes proteicos más relevantes, fue necesario la aplicación de herramientas quimiométricas de deconvolución y análisis multivariante, tales como la resolución multivariante de curvas por mínimos cuadrados alternos (MCR-ALS), el análisis de componentes principales (PCA), el análisis discriminante por mínimos cuadrados parciales (PLS-DA), los mapas de calor (heatmaps) y los gráficos de volcán (volcano plots).

Posteriormente, los métodos de LC-MS/MS y MALDI-TOF-MS asistidos por quimiometría desarrollados para la clasificación de las variedades comerciales sirvieron como base para el estudio de semillas y granos de diversas variedades genéticas de quinoa blanca, cultivadas bajo agricultura convencional y orgánica, o sometidas a procesos tecnológicos de ebullición y extrusión. Las muestras analizadas mediante LC-MS/MS pertenecían a la variedad Salcedo (V4), mientras que las muestras analizadas mediante MALDI-TOF-MS correspondían a esta variedad y a las variedades Quillahuamán (V1), Santa Ana (V2), y Altiplano (V3). En ambos estudios, de nuevo la combinación de estos métodos analíticos y las herramientas quimiométricas supervisadas y no supervisadas, permitieron la discriminación y clasificación de las diferentes muestras de quinoa según su composición proteica diferencial, además de la identificación de las proteínas más relevantes para su diferenciación. Esto confirma que las estrategias analíticas desarrolladas previamente para las variedades comerciales también permiten obtener una visión global, fiable y detallada de la influencia de los tipos de producción agrícola y tecnologías de procesamiento.

[eng] Quinoa stands out as a promising food due to its exceptional nutritional profile and its ability to adapt to extreme environmental conditions. These qualities have facilitated its widespread distribution worldwide. However, the increasing demand for quinoa makes it susceptible to adulteration with less expensive cereals, raising significant concerns among organizations responsible for ensuring food quality, safety, and authenticity. To overcome these challenges, along with those related to farming and processing conditions, there is an urgent need to develop advanced analytical methods for studying quinoa components, especially proteins. In this thesis, were developed untargeted analytical methods for the separation, identification, characterization, and quantification of protein extracts from quinoa grain commercial varieties. The most simple analytical approaches were based on protein fingerprinting by high-resolution separation techniques, such as capillary electrophoresis and liquid chromatography with spectrophotometric detection (CE-UV and LC-UV). Among the mass spectrometry (MS)-based techniques, liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was employed for comprehensive and detailed bottom-up proteomic characterization. The established proteomic map was investigated using a novel data mining strategy to identify proteins with potential immunonutritional properties. Additionally, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI- TOF-MS) was used to generate global fingerprints of quinoa proteins, which were tentatively identified based on the proteomic map. Chemometric tools for data deconvolution and multivariate analysis, including multivariate curve resolution by alternating least squares (MCR-ALS), principal component analysis (PCA), partial least squares discriminant analysis (PLS-DA), heatmaps, and volcano plots, were essential for interpreting the data in all these studies.

Subsequently, the developed LC-MS/MS and MALDI-TOF-MS methods, assisted by chemometrics, were employed to investigate seeds and grains from genetic varieties of white quinoa, cultivated under both conventional and organic farming practices, and subjected to boiling and extrusion. In both studies, the combination of these analytical methods with supervised and unsupervised chemometric tools were

applied to differentiate and classify the studied quinoa samples, as well as to identify the most critical proteins for sample discrimination. This confirmed that the analytical strategies developed for commercial varieties also provided a comprehensive, reliable, and detailed understanding of the influence of agricultural production and processing technologies.