Innovación en la detección de Legionella y en el cultivo de bacterias exigentes

Abstract

[spa] La legionelosis o enfermedad del legionario es una enfermedad infecciosa provocada por Legionella, una bacteria gramnegativa aeróbica estricta y un patógeno intracelular facultativo. Se transmite en humanos principalmente mediante la inhalación de aerosoles o la aspiración de fluidos procedentes de sistemas de agua públicos y privados. En los últimos años, se ha observado un aumento considerable en el número de casos. En la actualidad, el aislamiento de Legionella en muestras de agua continúa siendo un reto para la mayoría de laboratorios, siendo el cultivo el principal método de detección, con el uso de medios que contienen carbón activado: Buffered Charcoal Yeast Extract (BCYE), Glycine Vancomycin Polymyxin Cycloheximide (GVPC), etc. En estos medios, Legionella tiene un crecimiento lento (3 - 10 días), la selectividad es baja y la tonalidad oscura dificulta la diferenciación de colonias e impide el desarrollo de medios diferenciales/cromogénicos. Con tal de mejorar la detección de Legionella en cultivo, se implementaron las siguientes estrategias. En el Capítulo 1, se describe la mejora de las propiedades del medio selectivo GVPC al modificar las condiciones de fabricación (esterilización más suave y ausencia de oxígeno). Se observó que estos nuevos medios mejoraban el crecimiento de Legionella en comparación con el medio convencional (1 día antes para Legionella pneumophila y 2 antes para Legionella anisa), probablemente debido a una menor formación de compuestos reactivos de oxígeno en el agar. También se observó un incremento de la selectividad, especialmente frente a Enterococcus faecalis ATCC 29212 y Pseudomonas aeruginosa, posiblemente por una menor interacción de la polimixina con el carbón activado en ausencia de oxígeno. En el Capítulo 2, se comparó el rendimiento de filtros de membrana de distintos materiales y fabricantes para recuperar Legionella en muestras de agua. Se observó que las membranas de polietersulfona del fabricante 3 (3-PES) permiten un mayor crecimiento de L. pneumophila y L. anisa, con diferencias estadísticamente significativas en el tamaño de colonia y número de UFC en comparación con el resto de fabricantes y materiales (ésteres mixtos de celulosa y nitrocelulosa). 3-PES también confirió una mayor selectividad, especialmente frente a P. aeruginosa. Estas propiedades también se observaron en muestras de agua reales. Estos resultados pueden explicarse por las propiedades físicas diferenciales de 3-PES en comparación con el resto de materiales, especialmente por un menor grosor (130 μm), lo que permitiría un mayor transporte de nutrientes y de los antibióticos. En el Capítulo 3, se llevó a cabo el desarrollo de un medio cromogénico para la detección de Legionella. Primero, se llegó a la conclusión de que la opción más factible (en términos de productividad y selectividad) para obtener un medio claro capaz de visualizar diferentes pruebas colorimétricas (por ejemplo, la prueba de nitratos) es añadir un suplemento blanco opaco (dióxido de titanio) a los medios convencionales. Entre los sustratos cromogénicos evaluados (para actividades fosfatasa, esterasa/lipasa, aminopeptidasa y glicosidasa), se observó que la señal cromogénica obtenida en Legionella usando un cromógeno con un ácido graso de cadena corta como sustrato (A-AGC2) permitía una buena diferenciación del resto de bacterias gracias a un característico halo fluorescente alrededor de las colonias, que se puede correlacionar con una actividad esterasa extracelular mayor que en el resto de bacterias. La adición de otro cromógeno con un ácido graso de cadena larga como sustrato (A-AGL1) permitió una mejor diferenciación de las colonias de Pseudomonas, caracterizadas por una coloración roja, probablemente debido a la elevada producción de lipasas de este género bacteriano. Estos resultados apuntan a que A-AGC2 y A-AGL1 pueden ser útiles para obtener un medio cromogénico para la detección de Legionella, aunque son necesarios más estudios para obtener un medio definitivo que pueda ser comercializado a gran escala. Como estudio adicional, se evaluó la aplicación industrial del medio de cultivo agar chocolate, un medio de enriquecimiento para el aislamiento de bacterias exigentes y normalmente suplementado con sangre fresca desfibrinada tratada térmicamente. Dado que el uso de sangre fresca comporta una serie de inconvenientes como su elevado coste, dificultades para la manipulación y transporte, este producto no siempre es asequible para las empresas de los países en vías de desarrollo. Por otro lado, la sangre en polvo (SP) es una alternativa más barata, aunque su tratamiento previo antes de añadirse al medio produce precipitados que pueden dificultar la obtención de un medio homogéneo. Para poder obtener un medio análogo y más económico a gran escala que agar chocolate, se fabricaron medios usando un preparado de SP bovina comercializada para uso veterinario sometido a distintos pretratamientos y se compararon con el medio convencional. Los medios con SP pretratada fueron: 1) medio con SP tratada a altas temperaturas (AC-PT); 2) medio con SP esterilizada con radiación gamma (AC-PR) y 3) medio con SP triturada e irradiada (AC-PBR). El medio AC-PT proporcionó resultados microbiológicos similares al medio convencional. Sin embargo, suplemento de SP tratado a altas temperaturas formó una gran cantidad de precipitados durante el pretratamiento, descartándolo para la fabricación a escala industrial. En cuanto a AC-PR, se observó un bajo crecimiento de las bacterias exigentes, por lo que también se descartó. Con el uso de SP triturado y posteriormente irradiado en el medio (AC-PBR), se detectó un crecimiento de las bacterias exigentes (Neisseria, Haemophilus, Campylobacter, y Streptococcus) y de las no exigentes (Moraxella, Staphylococcus, Enterococcus, Klebsiella, y Pseudomonas) muy similar al control. A diferencia de AC-PT, no se formaron precipitados durante la fabricación del medio. Se observaron algunas diferencias de crecimiento en el medio AC-PBR respecto AC, como una mayor actividad α- hemolítica en Streptococcus pyogenes, una menor actividad α-hemolítica en S. pneumoniae, un crecimiento más lento de Haemophilus influenzae y una morfología rugosa en las colonias de P. aeruginosa. Estos cambios sugieren que los pretratamientos de trituración y radiación usados en SP producen una menor lisis de eritrocitos en comparación al tratamiento térmico, liberando menor cantidad de hemina y hemoglobina al medio, lo que podría llevar a obtener un medio intermedio entre agar sangre y agar chocolate. Aunque son necesarios más estudios, el uso de SP triturada e irradiada podría constituir un método práctico y económico para fabricar un análogo del agar chocolate a escala industrial.

[eng] Legionellosis or Legionnaires' disease is an infectious disease caused by Legionella, a strict aerobic gram- negative bacterium and a facultative intracellular pathogen. Its transmission usually occurs through inhalation of aerosols or aspiration of fluids from public and private water systems. In recent years, it has been observed a considerable increase in the number of cases reported. Currently, the isolation of Legionella in water samples continues to be a challenge for most laboratories. Culture remains to be the main method for Legionella testing, with the use of culture media containing activated carbon: Buffered Charcoal Yeast Extract (BCYE), Glycine Vancomycin Polymyxin and Cycloheximide (GVPC), etc. When using these media, Legionella’s growth is slow (3 - 10 days), with a low selectivity and the plates’ dark background difficult colony differentiation, preventing the development of differential/chromogenic media. Aiming to improve the detection of Legionella on culture media, different strategies were performed. In Chapter 1, the improvement of the properties of the GVPC selective medium by modifying manufacturing conditions (lower sterilization conditions and removal of oxygen) is described. When using these conditions, an improvement of Legionella’s growth was observed in comparison to the conventional medium (colony formation 1 day earlier for Legionella pneumophila and 2 days earlier for Legionella anisa), probably due to lower formation of reactive oxygen compounds on agar. An increase in selectivity properties was also observed, especially against Enterococcus faecalis ATCC 29212 and Pseudomonas aeruginosa, possibly due to a lower interaction of polymyxin with activated carbon on absence of oxygen. In Chapter 2, it was compared the performance of different 0.45 μm membrane filters from different manufacturers in recovering Legionella from water samples. It was appreciated that the polyethersulfone membranes from manufacturer 3 (3-PES) allowed higher growth of L. pneumophila and L. anisa, with statistically significant differences in colony size and number of CFU in comparison to the rest of the manufacturers and materials (mixed esters of cellulose and nitrocellulose). 3-PES also presented greater selectivity, especially against P. aeruginosa. The same properties were also observed in real water samples. These results can be explained by the differential physical properties of 3-PES compared to the rest of the materials, especially by its lower thickness (130 m), which would allow greater transport of nutrients and antibiotics. In Chapter 3, the development of a chromogenic medium for the detection of Legionella is described. First, it was observed the most feasible option to obtain a clear medium capable of visualizing different colorimetric tests (Ex: nitrate test), was the addition of an opaque white supplement (titanium dioxide) to the conventional medium. Among the chromogenic substrates evaluated (for phosphatase, esterase/lipase, aminopeptidase and glycosidase activities), it was observed that the chromogenic signal obtained in Legionella colonies using a short-chain fatty acid chromogenic substrate (A-AGC2) allowed a differentiation from the rest of the bacteria thanks to a characteristic fluorescent halo around the colonies, which can be correlated with a higher extracellular esterase activity than the rest of the bacteria. The addition of a long-chain fatty acid chromogenic substrate (A-AGL1) also allowed better differentiation of the Pseudomonas colonies, characterized by a red color, probably due to the high production of lipases. These results suggest that A-AGC2 and A-AGL1 substrates can be useful to obtain a chromogenic medium for the detection of Legionella, although more studies are necessary to obtain a definitive medium that can be commercialized at large scale.

As an additional study, the industrial application of the chocolate agar culture medium, an enrichment medium for the isolation of fastidious bacteria and normally supplemented with fresh defibrinated heat- treated blood, was studied. Given that the use of fresh blood presents a series of drawbacks such as its high cost, difficulties in handling and transportation, this product is not always affordable for companies in developing countries. On the other hand, powdered blood (SP) is a cheaper alternative, although its pretreatment before being added to the medium produces precipitates that can make it difficult to obtain a homogeneous medium. To obtain an analogous and more economical medium on a large scale than chocolate agar, media were manufactured using a preparation of bovine SP marketed for veterinary use subjected to different pretreatments and compared with the conventional medium. The media with pretreated SP were: 1) medium with SP treated at high temperatures (AC-PT); 2) medium with SP sterilized with gamma radiation (AC-PR) and 3) medium with ground and irradiated SP (AC-PBR). The AC- PT medium provided similar microbiological results to the conventional medium. However, SP supplement treated at high temperatures formed many precipitates during pretreatment, so it was discarded for industrial scale manufacturing. As for AC-PR, low growth of fastidious bacteria was observed, so it was also discarded. With the use of previously ground and irradiated SP (AC-PBR), the growth of fastidious (Neisseria, Haemophilus, Campylobacter, and Streptococcus) and non-fastidious bacteria (Moraxella, Staphylococcus, Enterococcus, Klebsiella, and Pseudomonas) was very similar to the control. Unlike AC- PT, no precipitates formed during medium manufacturing. Some growth differences were observed in the AC-PBR medium compared to AC, such as greater α-hemolytic activity in Streptococcus pyogenes, lower α-hemolytic activity in S. pneumoniae, slower growth of Haemophilus influenzae and a rugose morphology in the P. aeruginosa colonies. These changes suggest that the grinding and radiation pretreatments used in SP produce less erythrocyte lysis compared to thermal treatment, releasing a smaller amount of hemin and hemoglobin into the medium, which could lead to obtaining an intermediate medium between blood agar and chocolate agar. Although further studies are necessary, the use of ground and irradiated SP could constitute a practical and economical method for the industrial-scale manufacturing of a chocolate agar analogue.