Imaging and analytical tools to study the spatiotemporal dynamics of protein export

Abstract

(English) Intracellular trafficking, particularly protein secretion, faces numerous unresolved challenges. This thesis aims to provide and evaluate tools for quantitative investigation of these processes using fluorescent microscopy. Quantitative analysis offers two main benefits: detailed characterization of molecular dynamics for mechanistic understanding and objective measurements for accurate comparisons across experiments. In Chapter 1, we introduce the secretory pathway, a cellular pathway responsible for the synthesis, processing, sorting and delivery of secretory proteins to the extracellular environment. In Chapter 2, we provide a thorough description of the methodologies used in this thesis. They include various fluorescence microscopy techniques, automated image analysis, and biological methods tailored to the secretory pathway. The tools were selected to achieve high spatial and temporal resolution, enable quantitative analysis, and allow live-cell characterization. In Chapter 3, we used fluorescence imaging to objectively evaluate results in four projects addressing protein secretion and intracellular trafficking. These included quantifying colocalization and proximity of structures, measuring fluorescent intensity differences, and characterizing dynamics of particles like ERGIC-derived nanotubules. Consistent sample preparation and image acquisition, coupled with computational analysis, are crucial for accurate, unbiased results. Chapter 4 focuses on single-particle tracking (SPT) in the secretory pathway, proposing control experiments and parameter descriptors to maximize data quality. We emphasized labeling strategies, imaging, and data analysis considerations for reliable results. Chapter 5 applied these methodologies to study protein sorting at the TGN, examining the role of ER-Golgi membrane contact sites (MCS) in TGN-derived carrier biogenesis. Using super-resolution fluorescence microscopy, we identified cargo accumulation regions and conducted SPT experiments, revealing confined, slow motion of cargo proteins near MCS. This effect was inhibited by the lipid transfer blocker 25-HC, indicating upstream regulation of cargo localization preferences by MCS.

(Català) El tràfic intracel·lular, particularment la secreció de proteïnes, presenta nombrosos qüestions no resoltes. Aquesta tesi té com a objectiu proporcionar i avaluar eines per a la investigació quantitativa d’aquests processos mitjançant microscòpia fluorescent. L'anàlisi quantitativa ofereix dos avantatges principals: la caracterització detallada de les dinàmiques moleculars per a la comprensió mecànica i les mesures objectives per a comparacions precises entre experiments. Al Capítol 1, introduïm la via secretora, una via cel·lular responsable de la síntesi, processament, classificació i lliurament de proteïnes secretòries a l'entorn extracel·lular. Al Capítol 2, proporcionem una descripció exhaustiva de les metodologies utilitzades en aquesta tesi. Inclouen diverses tècniques de microscòpia de fluorescència, anàlisi d'imatges automatitzada i mètodes biològics adaptats a la via secretora. Les eines es van seleccionar per assolir una alta resolució espacial i temporal, permetre l'anàlisi quantitativa i permetre la caracterització en cèl·lules vives. Al Capítol 3, vam utilitzar la imatge de fluorescència per avaluar objectivament els resultats en quatre projectes que aborden la secreció de proteïnes i el tràfic intracel·lular. Aquests inclouen quantificar la colocalització i la proximitat d'estructures, mesurar diferències en intensitat fluorescent i caracteritzar dinàmiques de partícules com nanotúbuls derivats de l'ERGIC. La preparació consistent de mostres i l'adquisició d'imatges, juntament amb l'anàlisi computacional, són crucials per obtenir resultats precisos i imparcials. El Capítol 4 se centra en el seguiment de partícules individuals (SPT) en la via secretora, proposant experiments de control i descriptors de paràmetres per maximitzar la qualitat de les dades. Vam posar èmfasi en les estratègies de marcatge, la imatge i les consideracions d'anàlisi de dades per a resultats fiables. El Capítol 5 va aplicar aquestes metodologies per estudiar la classificació de proteïnes al TGN, examinant el paper dels llocs de contacte de membranes ER-Golgi (MCS) en la biogènesi dels transportadors derivats del TGN. Utilitzant microscòpia de fluorescència de super-resolució, vam identificar regions d’acumulació de càrrega i vam dur a terme experiments de SPT, revelant el moviment confinat i lent de les proteïnes de càrrega a prop dels MCS. Aquest efecte va ser inhibido pel bloquejador de transferència de lípids 25-HC, indicant una regulació ascendent de les preferències de localització de càrrega per part dels MCS.

(Español) El tráfico intracelular, particularmente la secreción de proteínas, presenta numerosas cuestiones no resueltas. Esta tesis tiene como objetivo proporcionar y evaluar herramientas para la investigación cuantitativa de estos procesos mediante microscopía fluorescente. El análisis cuantitativo ofrece dos ventajas principales: la caracterización detallada de las dinámicas moleculares para la comprensión mecanística y las mediciones objetivas para comparaciones precisas entre experimentos. En el Capítulo 1, introducimos la vía secretora, una vía celular responsable de la síntesis, procesamiento, clasificación y entrega de proteínas secretorias al entorno extracelular. En el Capítulo 2, proporcionamos una descripción exhaustiva de las metodologías utilizadas en esta tesis. Incluyen diversas técnicas de microscopía de fluorescencia, análisis de imágenes automatizado y métodos biológicos adaptados a la vía secretora. Las herramientas se seleccionaron para lograr una alta resolución espacial y temporal, permitir el análisis cuantitativo y facilitar la caracterización en células vivas. En el Capítulo 3, utilizamos la imagen de fluorescencia para evaluar objetivamente los resultados en cuatro proyectos que abordan la secreción de proteínas y el tráfico intracelular. Estos incluyen cuantificar la colocalización y proximidad de estructuras, medir diferencias en intensidad fluorescente y caracterizar dinámicas de partículas como nanotúbulos derivados del ERGIC. La preparación consistente de muestras y la adquisición de imágenes, junto con el análisis computacional, son cruciales para obtener resultados precisos e imparciales. El Capítulo 4 se centra en el seguimiento de partículas individuales (SPT) en la vía secretora, proponiendo experimentos de control y descriptores de parámetros para maximizar la calidad de los datos. Hicimos hincapié en las estrategias de marcaje, la imagen y las consideraciones de análisis de datos para obtener resultados fiables. El Capítulo 5 aplicó estas metodologías para estudiar la clasificación de proteínas en el TGN, examinando el papel de los sitios de contacto de membranas ER-Golgi (MCS) en la biogénesis de los transportadores derivados del TGN. Utilizando microscopía de fluorescencia de super-resolución, identificamos regiones de acumulación de carga y realizamos experimentos de SPT, revelando el movimiento confinado y lento de las proteínas de carga cerca de los MCS. Este efecto fue inhibido por el bloqueador de transferencia de lípidos 25-HC, indicando una regulación ascendente de las preferencias de localización de carga por parte de los MCS.