Single-cell transcriptomics of zebrafish heart regeneration with subcellular spatial resolution

Abstract

[eng] Adult zebrafish (Danio rerio), in contrast to mammals, can efficiently regenerate large portions of the heart after experimental damage or amputation. This process has been extensively studied we are beginning to understand the key events necessary for this regenerative response to happen. However, the cellular interplay and molecular mechanisms that govern the proliferation and migration of cardiomyocytes, as well as the termination of the regenerative process, have been only fragmentary explored. Understanding these mechanisms and exploiting them in the human context could open new therapeutic approaches to promote myocardial regeneration and prevent the development of heart failure. With this aim, we sought to determine the transcriptomic profile of healthy and regenerating zebrafish hearts at single-cell resolution, using novel transcriptomic approaches, and to analyze the importance of candidate genes in the regeneration process.

For this purpose, in the first part of the current thesis, we developed a tissue dissociation protocol using a cold active protease, from B. licheniformis, to minimize collagenase-associated artifacts introduced in single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analyses. We also made use of a droplet-based microfluidics encapsulation device that is particularly suitable for capturing both large (cardiomyocytes) and small (fibroblasts, endothelial, myeloid) size cells. Using these protocols, we have investigated changes in cell types and cardiomyocyte cell states in uninjured (Sham) zebrafish hearts, and after 7- and 30- days post amputation (DPA) . Due to the high sensitivity of scRNA-seq, we could find changes in gene expression that were not detected in previous bulk RNA-seq analyses. Our results identified novel markers to describe cardiomyocyte cell-states that are present in both healthy and regenerating myocardium. We then studied the transcriptomic changes of these cell-states, and we identified candidate genes with possible implication in heart regeneration.

In the second part of the current thesis, we sought to examine the importance of candidate genes in zebrafish heart regeneration. Our previous results showed that anxa2a, mustn1b, fhl1a and casq2 are dynamically expressed in cardiomyocytes and upregulated at 7 DPA. We followed a CRISPR/Cas9-based approach for loss-of-function experiments of these genes. Knock-out zebrafish did not exhibit any developmental defects or abnormal adult

phenotypes but failed to regenerate their myocardium after apex resection. For further characterization of the role(s) that these genes play during zebrafish heart regeneration, we developed two novel experimental platforms: 1) a cardiomyocyte-specific Ca2+ indicator reporter transgenic zebrafish line for monitoring calcium handling during zebrafish heart regeneration, and 2) an in vitro platform for measuring cell-autonomous behaviors in response to matrices of controlled stiffness.

In the third part, we have examined the transcriptomic changes in periostin b (postnb) knock-out animals that exhibit increased cardiomyocyte proliferation but fail to regenerate the ventricle upon injury. We found similar cellular composition between postnb-/- and wild type ventricles. However, postnb-/- mutant hearts showed changes in the proportions of cardiomyocytes, macrophages, fibroblasts, and epicardial cells at 7 DPA. To include spatial information about the expression of genes and infer gene regulatory networks, we performed spatial transcriptomics experiments. Our results demonstrate the suitability and efficiency of the technique for finding gene specific domains in the regenerating zebrafish heart.

[cat] El peix zebra adult (Danio rerio), a diferència dels mamífers, pot regenerar eficientment grans porcions del cor després de danys experimentals o amputacions. Aquest procés ha estat àmpliament estudiat i estem començant a entendre els esdeveniments clau necessaris perquè es produeixi aquesta resposta regenerativa. No obstant això, la interacció cel·lular i els mecanismes moleculars que governen la proliferació i migració dels cardiomiòcits, així com la finalització del procés regeneratiu, només s'han explorat fragmentàriament. Entendre aquests mecanismes i explotar-los en el context humà podria obrir nous enfocaments terapèutics per promoure la regeneració miocàrdica i prevenir el desenvolupament d'insuficiència cardíaca. Amb aquest objectiu, es va intentar determinar el perfil transcriptòmic de cors de peix zebra sans i regeneradors a resolució unicel·lular, utilitzant nous enfocaments transcriptòmics, i analitzar la importància dels gens candidats en el procés de regeneració.

Amb aquest propòsit, en la primera part de la present tesi, hem desenvolupat un protocol de dissociació de teixits utilitzant una proteasa activa en fred, de B. licheniformis, per minimitzar els artefactes associats a la col·lagenasa introduïts en les anàlisis de seqüenciació d'ARN de cèl·lules unicel·lulars (scRNA-seq). També hem utilitzat un dispositiu d'encapsulació microfluídica basat en gotes que és especialment adequat per capturar cèl·lules grans (cardiomiòcits) i petites (fibroblasts, endotelials, mieloides). Utilitzant aquests protocols, hem investigat canvis en els tipus de cèl·lules i els estats de les cèl·lules dels cardiomiòcits en cors de peix zebra il·lesos (Sham) i després de 7 i 30 dies després de l'amputació (DPA). A causa de l'alta sensibilitat de scRNA-seq, vam poder trobar canvis en l'expressió gènica que no es van detectar en anàlisis anteriors de seqüenciació d'ARN a granel. Els nostres resultats van identificar nous marcadors per descriure els estats de les cèl·lules dels cardiomiòcits que estan presents tant en el miocardi sa com en regeneració. Després vam estudiar els canvis transcriptòmics d'aquests estats cel·lulars i vam identificar gens candidats amb possibles implicacions en la regeneració del cor.

En la segona part de la tesi actual, es va tractar d'examinar la importància dels gens candidats en la regeneració del cor del peix zebra. Els nostres resultats anteriors van mostrar que anxa2a, mustn1b, fhl1a i casq2 s'expressen dinàmicament en cardiomiòcits i es regulen a 7 DPA. Vam seguir un enfocament basat en CRISPR/Cas9 per a experiments de pèrdua de funció d'aquests gens. El peix zebra no va presentar cap defecte de desenvolupament ni adult anormal dels fenotips però no van poder regenerar el seu miocardi després de la resecció de l'àpex. Per a una major caracterització del paper que juguen aquests gens durant la regeneració del cor del peix zebra, hem desenvolupat dues noves plataformes experimentals: 1) una línia de peix zebra reporter indicador Ca2+ específic de cardiomiòcits per monitoritzar la manipulació del calci durant la regeneració del cor del peix zebra, i 2) una plataforma in vitro per mesurar comportaments autònoms cel·lulars en resposta a matrius de rigidesa controlada.

A la tercera part, hem examinat els canvis transcriptòmics en animals knock-out de periostina b (postnb) que presenten una major proliferació de cardiomiòcits però no aconsegueixen regenerar el ventricle després de la lesió. Hem trobat una composició cel·lular similar entre els ventricles postnb-/- i de tipus salvatge. No obstant això, els cors mutants postnb-/- van mostrar canvis en les proporcions de cardiomiòcits, macròfags, fibroblasts i cèl·lules epicàrdiques a 7 DPA. Per incloure informació espacial sobre l'expressió de gens i inferir xarxes de regulació gènica, vam realitzar experiments de transcriptòmica espacial. Els nostres resultats demostren la idoneïtat i l'eficiència de la tècnica per trobar dominis específics gènics en el cor regenerador del peix zebra.