New humanized models of ischaemic stroke by endovascular approach in the pig: Study of pathophysiological pathways in the gyrencephalic brain and new biochemical and imaging biomarkers with translational potential

Abstract

L’ictus isquèmic (II) és una patologia freqüent caracteritzada per l’oclusió sobtada de les artèries que irriguen el cervell, provocant un deteriorament neurològic greu i, freqüentment, conseqüències mortals. L’eficàcia de les teràpies de reperfusió actuals depèn en gran mesu-ra del temps i els mètodes de diagnòstic es basen en tècniques de neuroimatge intra-hospitalàries que requereixen temps perllongats per diferenciar l’II agut (IIA) de patologies com l’ictus hemorràgic (IH), ja que un tractament inadequat pot agreujar l’evolució dels pacients. Així doncs, trobar biomarcadors sanguinis per diagnosticar eficaçment l’IIA po-dria facilitar una intervenció oportuna. A més, la recerca preclínica continuada no ha con-sumat en fàrmacs cerebroprotectors alternatius per l’IIA, possiblement degut l’ús de mo-dels insuficientment traslacionals. En la cerca d’aquests models, proposem el porc com a candidat ideal, amb cervell girencefàlic i una major proporció de substància blanca cerebral. Aquí presentem tres nous models d’II desenvolupats en porcs utilitzant una tècnica míni-mament invasiva i proposem un nou biomarcador candidat pel diagnòstic d’IIA. En primer lloc, per determinar la viabilitat d’arribar a les artèries cerebrals porcines mitja-nçant un abordatge endovascular, vam estudiar la seva anatomia arterial utilitzant angiogra-fia per catèter. L’ús de catèters neurointervencionistes disponibles en l’actualitat no va reve-lar cap accés practicable a aquestes artèries. No obstant, vam generar amb èxit el primer model d’II endovascular amb oclusió permanent i selectiva d’artèries cerebrals del cercle de Willis (CdW), demostrant característiques de neuroimatge associades a l’II clínic. L’anàlisi histològica va validar aquests resultats, fet que suggereix la fidelitat del model a l’hora de reproduir la patologia clínica de l’II. A més, aquest model va permetre una avaluació inicial del seu potencial per trobar biomarcadors sanguinis, mostrant un augment primerenc d’aminoàcids essencials (AAE) i aminoàcids ramificats (AAR), així com un augment poste-rior de la proteïna HSC70. Aquests resultats mostren l’establiment d’un model d’II en el porc utilitzant un abordatge mínimament invasiu i destaquen el seu potencial traslacional. Posteriorment, vam explorar la contribució específica del sistema arterial al cervell porcí, fet que ens va permetre generar altres models específics d’II. Així, vam generar dos nous mo-dels: un amb lesió subcortical als ganglis basals i un altre amb lesió per isquèmia-reperfusió. Ambdós es van induir mitjançat un abordatge mínimament invasiu i tenien lesions repro-duïbles per neuroimatge i anàlisis histològics. Aquest estudi valida la utilitat del porc en el modelat de presentacions d’II específiques comunes en humans. Finalment, vam investigar nous biomarcadors sanguinis pel diagnòstic precoç de l’IIA uti-litzant el model inicial de porc amb II. Les anàlisis metabolòmiques i lipidòmiques no diri-gides van revelar alteracions significatives en compostos aminoacídics com l’AAR isoleuci-na i diversos glicerofosfolípids després de l’oclusió arterial. Els perfils d’aminoàcids van identificar canvis diferents en l’IIA en comparació amb els grups control i d’IH, fet que destaca el potencial dels biomarcadors sanguinis per diferenciar l’IIA de malalties similars en el nostre model porcí. En particular, vam identificar el compost KN-160 com un pro-metedor biomarcador candidat, elevat en II però no en els grups control i d’IH. Aquesta troballa ressalta la implicació del metabolisme lipídic en la fisiopatologia de l’II i el poten-cial diagnòstic diferencial del compost KN-160 per IIA. En conclusió, aquesta tesi demostra la rellevància traslacional del porc en el modelat de subtipus específics d’II i destaca la utilitat dels biomarcadors sanguinis, en particular el compost KN-160, pel diagnòstic precoç de l’IIA. Aquests resultats ofereixen vies promete-dores per millorar el maneig de l’IIA i recalca la importància de models traslacionals robus-tos en la recerca de l’ictus.

El ictus isquémico (II) es una patología frecuente caracterizada por la oclusión brusca de las arterias que irrigan el cerebro, lo que provoca un deterioro neurológico grave y, frecuen-temente, desenlaces mortales. La eficacia de las terapias de reperfusión actuales depende en gran medida del tiempo y los métodos de diagnóstico se basan en técnicas de neuroimagen intrahospitalarias que requieren tiempos prolongados para diferenciar el II agudo (IIA) de patologías como el ictus hemorrágico (IH), ya que un tratamiento inadecuado puede agra-var la evolución de los pacientes. Así pues, encontrar biomarcadores sanguíneos para diag-nosticar eficazmente el IIA podría facilitar una intervención oportuna. Además, la investi-gación preclínica continuada no ha consumado en fármacos cerebroprotectores alternativos para el IIA, posiblemente debido al uso de modelos insuficientemente traslacionales. En la búsqueda de tales modelos, proponemos al cerdo como candidato ideal, con cerebro giren-cefálico y una mayor proporción de sustancia blanca cerebral. Aquí presentamos tres nue-vos modelos de II desarrollados en cerdos utilizando una técnica mínimamente invasiva y proponemos un nuevo biomarcador candidato para el diagnóstico de IIA. En primer lugar, para determinar la viabilidad de llegar a las arterias cerebrales porcinas mediante un abordaje endovascular, estudiamos su anatomía arterial utilizando angiografía por catéter. El uso de catéteres neurointervencionistas disponibles en la actualidad no reve-ló ningún acceso practicable a estas arterias. No obstante, generamos con éxito el primer modelo de II endovascular con oclusión permanente y selectiva de arterias cerebrales del círculo de Willis (CdW), demostrando características de neuroimagen asociadas al II clíni-co. El análisis histológico validó estos hallazgos, lo que sugiere la fidelidad del modelo a la hora de reproducir la patología clínica del II. Además, este modelo permitió una evaluación inicial de su potencial para encontrar biomarcadores sanguíneos, mostrando un aumento temprano de aminoácidos esenciales (AAE) y aminoácidos ramificados (AAR), así como un aumento posterior de la proteína HSC70. Estos resultados muestran el establecimiento de un modelo de II en el cerdo utilizando un abordaje mínimamente invasivo y destacan su potencial traslacional. Posteriormente, exploramos la contribución específica del sistema arterial al cerebro por-cino, lo que nos permitió generar otros modelos específicos de II. Así, generamos dos modelos novedosos: uno con lesión subcortical en los ganglios basales y otro con lesión por isquemia-reperfusión. Ambos modelos se indujeron mediante un abordaje mínimamen-te invasivo y mostraron lesiones reproducibles mediante neuroimagen y análisis histológi-cos. Este estudio valida la utilidad del cerdo en la modelización de presentaciones específi-cas de II comunes en humanos. Finalmente, investigamos nuevos biomarcadores sanguíneos para el diagnóstico precoz del IIA utilizando el modelo inicial de cerdo con II. Los análisis metabolómicos y lipidómicos no dirigidos revelaron alteraciones significativas en los compuestos aminoacídicos como el AAR isoleucina y varios glicerofosfolípidos tras la oclusión arterial. Los perfiles de aminoá-cidos identificaron cambios distintos en el IIA en comparación con los grupos control e IH, lo que destaca el potencial de los biomarcadores sanguíneos para diferenciar el IIA de enfermedades similares en nuestro modelo porcino. En particular, identificamos el com-puesto KN-160 como un prometedor biomarcador candidato, elevado tras el II pero no en los grupos control e IH. Este hallazgo subraya la implicación del metabolismo lipídico en la fisiopatología del II y el potencial diagnóstico diferencial del compuesto KN-160 en el IIA. En conclusión, esta tesis demuestra la relevancia traslacional del cerdo en la modelización de subtipos específicos de II y destaca la utilidad de los biomarcadores sanguíneos, en particular el compuesto KN-160, en el diagnóstico precoz del IIA. Estos hallazgos ofrecen vías prometedoras para mejorar el manejo del IIA y subrayan la importancia de modelos traslacionales robustos en la investigación del ictus.

Ischaemic stroke (IS) is a frequent pathology characterized by the abrupt occlusion of arter-ies irrigating the brain, leading to severe neurological impairment and often fatal outcomes. The efficacy of current reperfusion therapies is markedly time-dependent and diagnostic methods rely on time-intensive in-hospital neuroimaging techniques to differentiate acute IS (AIS) from conditions like haemorrhagic stroke (HS), as inappropriate treatment can exacerbate patient outcomes. Thus, finding blood biomarkers to efficiently diagnose AIS could facilitate a timely intervention. Additionally, continued preclinical research has not consummated in alternative cerebroprotective drugs for AIS, possibly due to the use of insufficiently translational models. In pursuit of such models, we propose the pig, with its gyrencephalic brain and a higher proportion of cerebral white matter, as an ideal candidate. Here, we present three novel IS models developed in swine using a minimally invasive technique and propose a novel biomarker candidate for AIS diagnosis. First, to determine the feasibility of reaching the porcine cerebral arteries using an endovas-cular approach, we studied its arterial anatomy using catheter angiography. Currently-available neurointerventional catheters did not reveal any practicable access to these arteries. Nevertheless, we successfully generated the first endovascular IS model involving targeted permanent occlusion of cerebral arteries from the circle of Willis (CoW), demonstrating neuroimaging hallmarks associated with clinical IS. Histological analysis validated these findings, suggesting the fidelity of the model in replicating clinical IS pathology. Additional-ly, this model allowed an initial evaluation of its potential to find blood biomarkers, show-ing an early increase in essential amino acids (EAAs) and branched-chain amino acids (BCAAs) as well as a posterior increase of the protein HSC70. These results show the suc-cessful establishment of an IS model in the pig using a minimally invasive approach and highlight its translational potential. Subsequently, we explored the specific contribution of the arterial system to the pig brain, allowing us to generate other specific IS models. Thus, two novel models were generated: one with subcortical damage to basal ganglia structures and another with ischemia-reperfusion injury. Both models were induced using a minimally invasive approach and exhibited reproducible lesions by neuroimaging and histological analyses. This study vali-dates the pig's utility in modelling specific IS scenarios common in humans. Finally, we investigated new blood biomarkers for early AIS diagnosis using the initial IS pig model. Untargeted metabolomics and lipidomics analyses revealed significant alterations in amino acididic compounds, such as the BCAA isoleucine, and several glycerophospho-lipids following arterial occlusion. Targeted amino acid profiling identified distinct changes in IS compared to sham and HS groups, highlighting the potential of blood biomarkers in differentiating AIS from mimicking diseases in our swine model. Notably, we identified the KN-160 compound as a promising candidate biomarker, elevated after IS but not in the sham and HS groups. This finding underscores the involvement of lipid metabolism in IS pathophysiology and the differential diagnostic potential of the KN-160 compound in AIS. In conclusion, our study demonstrates the pig's translational relevance in modelling specific IS subtypes and highlights the utility of blood biomarkers, particularly the KN-160 com-pound, in early AIS diagnosis. These findings offer promising avenues for improved IS management and underscore the importance of robust translational models in stroke re-search.