Development of a Biomanufacturing Process to Produce Duck Adipose-like Tissue

Abstract

L'auge en la demanda d'aliments ha comportat un augment de solucions innovadores per produir nous aliments, especialment per substituir els aliments derivats d'animals. Entre aquestes solucions, ha destacat els darrers anys l'agricultura cel·lular, que es basa en l'ús de cèl·lules animals per aconseguir derivats animals sense implicar animals en el procés. L'objectiu de la present tesi, emmarcada en el camp de l'agricultura cel·lular, és desenvolupar un sistema de producció de greix d'ànec cultivat. Per aconseguir això, s'han abordat alguns dels reptes més importants d'aquest nou camp, com són l'aïllament i la caracterització de noves cèl·lules d'interès alimentari, el desenvolupament de medis de cultiu lliures de components animals i eficients en termes de costos, i la intensificació i escalat en bioreactor del procés de producció de greix. A continuació, es fa una breu descripció dels quatre capítols que componen aquesta tesi, així com dels objectius i els resultats principals de cadascun d'aquests apartats. Al capítol u es va estudiar la viabilitat de l'ús de fibroblasts extrets d'embrions d'ànec (DEF per les sigles en anglès) per a la producció de greix. Per això, es van extreure cèl·lules de diferents ous i es va estudiar la variabilitat en termes de proliferació entre elles, principalment el temps de duplicació i el nombre de duplicacions que eren capaços de dur a terme. A més, es va demostrar mitjançant tècniques d'anàlisi de l'expressió de gens i microscòpia de fluorescència, que els DEF eren capaços de diferenciar-se a adipòcits en exposar-les a inductors de la diferenciació adipogènica. Un cop demostrada la viabilitat de l'ús d'aquest tipus cel·lular per al present projecte, es va decidir desenvolupar dos medis de cultiu específics per a expandir-los i diferenciar-los. Els resultats del desenvolupament d'aquests dos medis de cultiu es recullen als capítols dos i tres. Per desenvolupar els medis, es va fer primer una recerca 14 bibliogràfica de possibles molècules que fossin beneficioses per a un o altre fi, seguit d'un cribratge per determinar quines tenien un efecte estadísticament significatiu i finalment una optimització de les sinergies entre elles, maximitzant els efectes biològics mentre es limitava al màxim els costos del medi de cultiu. Per això es van fer servir diferents metodologies de disseny d'experiments (DoE per les sigles en anglès). Com a resultat, es van obtenir dos medis de cultiu lliures de sèrum que sostenien eficientment la proliferació i la diferenciació dels fibroblasts embrionaris d'ànec. Al quart i darrer capítol, abordem la intensificació del procés a escala de bioreactor per al cultiu de cèl·lules adherents. Per fer això, es van implementar i optimitzar els protocols de proliferació prèviament desenvolupats en 2D, en condicions 3D usant microcarriers Cytodex 1. Es van fer servir DoEs per a l'optimització dels paràmetres de cultiu, posant a punt la proliferació i l'adipogènesi usant sistemes de semi- perfusió en flascons agitats. Posteriorment, es va estudiar el cultiu dels fibroblasts en microcarriers usant diferents sistemes d'agitació en reactor: basculant, orbital i mitjançant agitació amb pales. Fent això, es va determinar la impossibilitat de cultivar les cèl·lules en els dos primers sistemes, a causa de l'estrès de cisallament. D'altra banda, al reactor de pales es va aconseguir cultivar les cèl·lules, obtenint valors de proliferació i diferenciació similars als obtinguts prèviament en 2D. Com a conclusió, aquesta tesi ha abordat reptes importants de l'agricultura cel·lular i ha ajudat a tancar alguns dels forats tecnològics existents, especialment pel que fa al desenvolupament de medis de cultiu, a l'establiment de noves cèl·lules amb interès per a la indústria alimentària, i a la intensificació de la proliferació i diferenciació de les cèl·lules d'ànec a escala de reactor, asseient una base sòlida sobre la qual treballar per dur a terme la futura industrialització del procés d'agricultura cel·lular.

El auge en la demanda de alimentos ha traído consigo un aumento de soluciones innovadoras para producir nuevos alimentos, especialmente para sustituir a los productos derivados de animales. Entre estas soluciones, la agricultura celular ha destacado en los últimos años, la cual se basa en el uso de células animales para obtener productos derivados sin implicar animales en el proceso. El objetivo de la presente tesis, enmarcada en el campo de la agricultura celular, es desarrollar un sistema de producción de grasa de pato cultivada. Para lograrlo, se han abordado algunos de los mayores retos de este campo emergente, como el aislamiento y la caracterización de nuevas células de interés alimentario, el desarrollo de medios de cultivo libres de componentes animales y eficientes en términos de costes, y la intensificación y escalado del proceso de producción de grasa en biorreactores. A continuación, se presenta una breve descripción de los cuatro capítulos que componen esta tesis, así como los objetivos y principales resultados de cada uno de ellos. En el capítulo uno, se estudió la viabilidad del uso de fibroblastos extraídos de embriones (DEF por sus siglas en inglés) de pato para la producción de grasa. Para ello, se extrajeron células de distintos huevos y se analizó la variabilidad en términos de proliferación entre ellas, principalmente el tiempo de duplicación y el número de duplicaciones que eran capaces de realizar. Además, se demostró, mediante técnicas de análisis de la expresión génica y microscopía de fluorescencia, que los fibroblastos de pato eran capaces de diferenciarse en adipocitos al ser expuestos a inductores de la diferenciación adipogénica. Una vez demostrada la viabilidad del uso de este tipo celular para el presente proyecto, se decidió desarrollar dos medios de cultivo específicos para su proliferación y diferenciación. Los resultados del desarrollo de estos medios de cultivo se describen en 12 los capítulos dos y tres. Para desarrollar los medios, primero se realizó una búsqueda bibliográfica de posibles moléculas beneficiosas para uno u otro fin, seguida de un cribado para determinar cuáles de ellas tenían un efecto estadísticamente significativo, y finalmente una optimización de las sinergias entre ellas, maximizando los efectos biológicos mientras se limitaban al máximo los costes del medio de cultivo. Para ello, se utilizaron diversas metodologías de diseño de experimentos (DoE, por sus siglas en inglés). Como resultado, se obtuvieron dos medios de cultivo libres de suero que sostenían de manera eficiente la proliferación y la diferenciación de los DEF. En el cuarto y último capítulo, se abordó la intensificación del proceso a escala de biorreactor para el cultivo de células adherentes. Para ello, se implementaron y optimizaron los protocolos de proliferación previamente desarrollados en 2D, en condiciones 3D utilizando microcarriers Cytodex 1. Se emplearon DoEs para la optimización de los parámetros de cultivo, ajustando la proliferación y la adipogénesis mediante sistemas de semi-perfusión en frascos agitados. Posteriormente, se estudió el cultivo de fibroblastos en microcarriers utilizando distintos sistemas de agitación en reactores: basculante, orbital y con agitación mediante palas. A través de este estudio, se determinó la imposibilidad de cultivar las células en los dos primeros sistemas debido al estrés de cizallamiento. Por otro lado, en el reactor de palas se consiguió cultivar las células, obteniendo valores de proliferación y diferenciación similares a los obtenidos previamente en 2D. En conclusión, esta tesis ha abordado importantes retos de la agricultura celular y ha contribuido a cerrar algunas de las brechas tecnológicas existentes, especialmente en lo relativo al desarrollo de medios de cultivo, al establecimiento de nuevas células de interés para la industria alimentaria, y a la intensificación de la proliferación y diferenciación de las células de pato a escala de reactor, sentando una base sólida para la futura industrialización del proceso de producción de grasa de pato mediante agricultura celular.

The rise in demand for food has brought with it an increase in innovative solutions for the production of novel foods, especially as substitutes for animal-derived food products. Among these solutions, cellular agriculture has positioned itself as one of the most promising in recent years. This technology is based on the use of animal cells to produce animal-derived products without involving animals in the process. The aim of the present thesis, framed within the field of cellular agriculture, is to develop a bioprocess for the production of cell-based duck fat. To accomplish this, some of the most important challenges in the field have been addressed, such as the isolation and characterization of novel cells from agriculturally relevant species, the development of animal component-free culture media that are cost-efficient, and the intensification and scale-up of the fat production process to the bioreactor scale. Here is a brief description of the four chapters that constitute this work, as well as the main objectives and results of each. In Chapter One, the viability of using fibroblasts isolated from duck embryos (DEF) for the production of fat was assessed. To do this, cells from different eggs were extracted, and their variability in terms of proliferation parameters, such as population doubling time and number of doublings, was assessed. Moreover, gene expression analysis and fluorescence microscopy techniques were used to demonstrate the capability of to differentiate into adipocytes and accumulate lipid droplets. Once the viability of this cell type for its use in the project was demonstrated, two specific culture media were developed to sustain the proliferation and differentiation of duck embryonic fibroblasts. The development of these media is presented in Chapters Two and Three. To develop the media, a bibliographic review of possible beneficial molecules for proliferation or differentiation was conducted, followed by a screening to determine which of them had a significant effect, concluding with an optimization of the synergies between them, maximizing the biological effect while limiting medium costs. To achieve this, the use of different design of experiments (DoE) methodologies was crucial. In the end, two culture media were obtained that sustained the proliferation and adipogenesis of DEF. In the fourth and final chapter, the intensification of the process to bioreactor scale was assessed. For this, protocols for proliferation and differentiation previously developed in 2D cultures were implemented and optimized using Cytodex 1 microcarrier cultures. DoEs were employed for the optimization of the culture parameters and adipogenesis in shake flasks operated under semi-perfusion regimes. After that, different agitation systems in bioreactors were studied: rocking, orbital, and stirred. By doing this, it was determined that the rocking and orbital systems were unable to sustain DEF proliferation due to the high shear stress. On the other hand, the stirred system sustained not only proliferation but also differentiation, achieving similar values to those previously determined in 2D. To summarize, this thesis has addressed some of the key challenges in the field of cellular agriculture, helping to fill some technological gaps, especially regarding the development of culture media, the establishment of new cell types from agriculturally relevant species, and the intensification and scale-up of DEF expansion and differentiation in microcarriers at bioreactor scale, laying the groundwork for the future industrialization of the duck adipose-like production process.