Second-generation feedstocks for sustainable sophorolipids production: submerged and solid-state fermentation approaches

Abstract

La recerca de processos sostenibles enfocats a la valorització de residus i la bioeconomia circular per part de la comunitat científica ha promogut el desenvolupament de noves cadenes de valor per a la generació de productes comercialitzables. Dins aquest marc, els soforolípids (SLs), un tipus de tensioactiu microbià produït principalment per Starmerella bombicola, entre altres llevats, presenten característiques respectuoses amb el medi ambient, fet que els converteix en possibles substituts dels surfactants químics. El present treball s'emmarca dins del projecte Surfing Waste el propòsit del qual és la producció de biosurfactants glicolips a partir de residus, una alternativa als surfactants químics en la bioeconomia circular, Ministeri de Ciència i Innovació, (PID2020-114087RB-I00) i representa la continuació de la línia d'investigació per a la producció de SLs mitjançant fermentació en estat sòlid (SSF). Aquesta recerca es va centrar principalment en la SSF i, mitjançant col·laboració internacional amb el Dr. James Winterburn The University of Manchester, es va avaluar també el procés en fermentació submergida (SmF), aportant aquest coneixement al grup. El primer bloc (Capítol 4) d'aquesta investigació es va centrar en optimitzar les fonts de carboni hidrofílic (glucosa) i la font de nitrogen (urea) mitjançant un disseny experimental de tipus Box-Behnken en SSF a escala Erlenmeyer. Posteriorment, es va fer una comparació entre el ràtio optimitzat i el ràtio reportat a la literatura utilitzant reactors de 0,5 L. A partir dels valors optimitzats, es van substituir els substrats purs (glucosa, urea) per residus industrials i municipals. A més de les fonts de nutrients descrites, és essencial una font de carboni hidrofòbic en el procés, per la qual cosa, en el segon bloc (Capítol 5), es va ampliar el rang de residus hidrofòbics utilitzats en la SSF fins al moment en el procés mitjançant la substitució del residu de winterització d'oli de gira-sol (utilitzat pel grup com a residu hidrofòbic model) per tortes de premsat de llavors (subproducte de la indústria de l'oli). Aquests experiments es van realitzar utilitzant reactors de 0,5 L i escalant el procés fins a 22 L, on la torta de premsat de germen de blat de moro i la torta de premsat de colza van mostrar resultats prometedors. A més, es va destacar la relació entre el contingut d'àcids grassos lliures en el residu hidrofòbic i la composició final de l'extracte cru de SLs. El tercer bloc (Capítol 6) es va dur a terme com a part d'una estada internacional, on es va utilitzar la proteasa comercial d'Aspergillus niger per avaluar l'ús d'hidrolitzats de residus agroindustrials com a fonts de nitrogen en SmF. On es van avaluar diferents concentracions de nitrogen i es va escalar la millor combinació d'Erlenmeyer (250 mL) a bioreactor de 2 L, obtenint resultats prometedors amb l’hidrolitzat de blat. A més, al llarg de la tesi es va treballar constantment en la identificació i quantificació de SLs mitjançant tècniques cromatogràfiques (HPLC-UV/HPLC-MS) per aportar precisió als resultats reportats fins al moment, que es basen en l'extracte cru de SLs. Finalment, en el Capítol 7 es planteja una discussió global sobre l'aplicació de residus per a la producció sostenible de SLs, establint un criteri de selecció per al seu ús. A més, es presenta un enfocament innovador on es planteja l'ús de SSF i SmF com a estratègies complementàries amb un mateix objectiu: l'aprofitament absolut del residu i la bioeconomia circular.

La búsqueda de procesos sostenibles enfocados en la valorización de residuos y la bioeconomía circular por parte de la comunidad científica ha promovido el desarrollo de nuevas cadenas de valor para la generación de productos comercializables. Dentro de este marco, los soforolípidos (SLs), un tipo de tensoactivo microbiano producido principalmente por Starmerella bombicola, presentan características amigables con el ambiente, lo que los convierte en posibles sustitutos de los surfactantes químicos. El presente trabajo está enmarcado dentro del proyecto Surfing Waste cuyo propósito es la producción de biosurfactantes glicolípidos a partir de residuos, una alternativa a los surfactantes químicos en la bioeconomía circular, Ministerio de Ciencia e Innovación, (PID2020-114087RB-I00) y representa la continuación de la línea de investigación para la producción de SLs mediante fermentación en estado sólido (SSF). Esta tesis se enfocó principalmente en la SSF y, mediante colaboración internacional con el Dr. James Winterburn The University of Manchester, también se evaluó el proceso en fermentación sumergida (SmF), aportando con este conocimiento al grupo. El primer bloque (Capítulo 4) de esta investigación se centró en optimizar las fuentes de carbono hidrofílico (glucosa) y la fuente de nitrógeno (urea) mediante un diseño experimental tipo Box-Behnken en SSF a escala Erlenmeyer. Posteriormente, se realizó una comparativa entre el ratio optimizado y el ratio reportado en la literatura en reactores de 0.5 L. Finalmente, a partir de los valores optimizados, se sustituyeron los sustratos puros (glucosa, urea) por residuos industriales y municipales. Además de las fuentes de nutrientes descritas, una fuente de carbono hidrofóbico es esencial en el proceso, por ello en el segundo bloque (Capítulo 5), se amplió el rango de residuos hidrofóbicos utilizados hasta el momento en SSF sustituyendo el residuo de winterización de aceite de girasol (utilizado por el grupo como residuo modelo) por diferentes tortas de prensado de semillas (subproducto de la industria del aceite). Los experimentos se realizaron en reactores de 0.5 L y se escaló el proceso a 22 L, donde las torta de prensado de germen de maíz y colza mostraron resultados prometedores. A su vez, se destacó la relación entre el contenido de ácidos grasos libres en el residuo hidrofóbico y la composición del extracto crudo de SLs. El tercer bloque (Capítulo 6) se realizó como parte de una estancia internacional, donde se utilizó la proteasa comercial de Aspergillus niger para evaluar el uso de hidrolizados de residuos agroindustriales como fuentes de nitrógeno en SmF. Donde se evaluaron distintas concentraciones de nitrógeno y se escaló la mejor combinación de Erlenmeyer (250 mL) a biorreactor de 2 L, obteniendo resultados prometedores con el hidrolizado de trigo. Además de ello, a lo largo de la tesis se trabajó constantemente en la identificación y cuantificación de SLs mediante técnicas cromatográficas (HPLC-UV/HPLC-MS), con el fin de aportar precisión a los resultados reportados hasta el momento, los cuales se basan en el extracto crudo de SLs. Finalmente, en el Capítulo 7 se plantea una discusión global sobre la aplicación de residuos para la producción sostenible de SLs, estableciendo un criterio de selección para su uso ya su vez, se presenta un enfoque novedoso donde se plantea el uso de SSF y SmF como estrategias complementarias con un mismo fin: el aprovechamiento absoluto del residuo y la bioeconomía circular.

Sustainable processes centered on residues valorization and circular bioeconomy have driven the scientific community to develop new value chains for producing marketable products. Within this context, sophorolipids (SLs), a class of microbial surfactants produced mainly by Starmerella bombicola, exhibit environmentally friendly properties, making them potential substitutes for conventional chemical surfactants. This research contributes to the "Surfing Waste" project (Biosurfactantes glicolipidos a partir de residuos, una alternativa a los surfactantes quimicos en la bioeconomia circular, Ministerio de Ciencia e Innovación, PID2020-114087RB-I00) and extends ongoing research on the production of SLs from waste through solid-state fermentation (SSF). The primary focus of this thesis was SSF, with an additional evaluation of the process in submerged fermentation (SmF) conducted in collaboration with Dr. James Winterburn at The University of Manchester, thereby contributing this knowledge to the group. The initial phase of this research (Chapter 4) involved the optimization of hydrophilic carbon sources (glucose) and nitrogen sources (urea) using a Box-Behnken experimental design within SSF at the Erlenmeyer scale. A subsequent comparison was made between the optimized ratio and those reported in the literature, using 0.5 L reactors. Following the optimization, pure substrates (glucose, urea) were substituted with industrial and municipal waste. Beyond the described nutrient sources, the process requires a hydrophobic carbon source. Consequently, in the second phase (Chapter 5), the scope of hydrophobic residues in SSF was broadened by replacing sunflower winterization oil cake (employed by the group as the model hydrophobic residue) by different oilseed cakes (a byproduct of the oil industry). These experiments were conducted using 0.5 L reactors, with a scale-up to 22 L reactors, where corn oilseed cake and rapeseed oilseed cake yielded promising results. Additionally, the study highlighted the correlation between the free fatty acid content in the hydrophobic residue and the final composition of the SLs crude extract. The third phase (Chapter 6) was conducted as part of an international research collaboration, where commercial protease from Aspergillus niger was employed to evaluate the use of hydrolysates derived from agro-industrial residues as nitrogen sources in SmF. Several nitrogen concentrations were evaluated and the best outcome was scaled from the shake flask (250 mL) to a 2 L reactor, obtaining promising results with wheat hydrolysate. Throughout this thesis, significant efforts were dedicated to the identification and quantification of SLs using chromatographic techniques (HPLC-UV/HPLC-MS) to enhance the precision of results, which have commonly been based on SLs crude extract. Finally, Chapter 7 presents a global discussion on the application of second-generation feedstock in the sustainable production of SLs, proposing selection criteria for their use. Additionally, a novel approach is introduced, advocating for the integration of SSF and SmF as complementary strategies with the same goal: the absolute utilization of a residue within the framework of circular bioeconomy.