Understanding the cell density effect upon transient transfection in HEK293 cell culture during HIV-1 VLP production

Abstract

L'expressió gènica transitòria (TGE) ha guanyat interès per a la fabricació de productes biològics en els darrers anys. La creixent demanda de vectors de teràpia gènica i l'augment de la medicina personalitzada requereixen millores contínues en aquest tipus de processos per fer front a aquestes necessitats creixents. No obstant això, la implementació industrial de la TGE es veu obstaculitzada pel cell density effect (CDE). Aquest fenomen cel·lular planteja serioses limitacions en la densitat cel·lular òptima per a una TGE eficient, reduint així la productivitat volumètrica del bioprocés. Per tant, la comercialització de molts productes biofarmacèutics basats en TGE està restringida, sent inviable en molts casos. Aquesta tesi doctoral explora els mecanismes cel·lulars subjacents al CDE durant la producció de partícules similars a virus (VLPs) del virus de la immunodeficiència humana (HIV-1) en cèl·lules HEK293 utilitzant transfecció basada en polietilenimina (PEI). Aquestes VLPs són nanoestructures derivades de virus que manquen de qualsevol material genètic que pugui iniciar un cicle infecciós. En el primer capítol, es va estudiar la relació entre les vesícules extracel·lulars (EVs) i el CDE. Es va demostrar la disrupció dels complexos DNA/PEI en medis de cultiu cel·lulars saturats de EVs. A més, els complexos van romandre atrapats en endosomes intracel·lulars a altes densitats cel·lulars (HCD), impedint la transfecció. L'eficiència de la transfecció es va poder restaurar quan s'eliminaven les EVs del medi gastat. Finalment, la sobreexpressió de la UDP-glucosa ceramida glucosil-transferasa (UGCG) va disminuir el segrest intracel·lular dels complexos i va millorar l'eficiència de la transfecció. El segon capítol d'aquesta tesi es va centrar en l'estudi de la mecànica cel·lular que interrompia l'estabilitat dels complexos DNA/PEI a HCD. Es va dur a terme una investigació sobre les vies d'absorció dels complexos, resultant en una caracterització del mecanisme de transfecció basat en PEI. L'anàlisi elemental dels complexos incubats en medi gastat va revelar un augment substancial en la seva força iònica. A més, es va adsorbir sofre en aquestes condicions, cosa que suggereix l'acumulació de molècules que contenen sofre en el medi extracel·lular. L'elevada força iònica va resultar en l'agregació dels complexos. L'elucidació dels mecanismes de transfecció es va aconseguir mitjançant la inhibició i el marcatge de proteoglicans (PGs) específics de la superfície cel·lular. L'absorció dels complexos semblava iniciar-se per un fenomen de coalescència de proteoglicans de sulfat d’heparà (HSPGs) com Glypican – 4 (GPC-4), al voltant dels punts d'entrada. En el tercer capítol, es va realitzar un estudi transcriptòmic en cultius de cèl·lules HEK293. El disseny experimental va permetre una comparació entre condicions de recanvi de medi (MRs), a dues densitats cel·lulars diferents. Els efectes restauratius de la transfecció exhibits pel medi deplecionat d'EVs probablement s'atribuïen a canvis en la naturalesa fisicoquímica del propi medi. El transport nucli-citoplasmàtic es va aturar i la producció d'histones es va incrementar quan s'utilitzava el medi deplecionat d'EVs. La posterior identificació proteòmica del medi deplecionat d'EVs va revelar que les cèl·lules experimentaven un estat similar a una infecció que estimulava les vies d'alliberament de virions. Finalment, es va hipotetitzar que l'acumulació de la matriu extracel·lular era un factor clau en el CDE. L'últim capítol es va centrar en la caracterització del producte, amb l'objectiu d'establir una avaluació rutinària dels atributs crítics de qualitat (CQAs). Les VLPs derivades de la transfecció per lots i les produccions d'expressió gènica estesa (EGE) es van sotmetre a una sèrie de tècniques de caracterització. L'impacte de la productivitat específica en els CQAs també es va estudiar mitjançant estratègies de silenciament gènic. Es van observar diferències en les propietats biofísiques de les nanopartícules amb la metodologia emprada.

La expresión génica transitoria (TGE) ha ganado interés para la fabricación de productos biológicos en los últimos años. La creciente demanda de vectores de terapia génica y el aumento de la medicina personalizada requieren mejoras continuas en este tipo de procesos para hacer frente a estas necesidades crecientes. Sin embargo, la implementación industrial de la TGE se ve obstaculizada por el cell density effect (CDE). Este fenómeno celular plantea serias limitaciones en la densidad celular óptima para una TGE eficiente, reduciendo así la productividad volumétrica del bioproceso. Por lo tanto, la comercialización de muchos productos biofarmacéuticos basados en TGE está restringida, siendo inviable en muchos casos. Esta tesis doctoral explora los mecanismos celulares subyacentes al CDE durante la producción de partículas similares a virus (VLPs) del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1) en células HEK293 utilizando transfección basada en polietilenimina (PEI). Estas VLPs son nanoestructuras derivadas de virus que carecen de cualquier material genético que pueda iniciar un ciclo infeccioso. En el primer capítulo, se estudió la relación entre las vesículas extracelulares (EVs) y el CDE. Se demostró la disrupción de los complejos DNA/PEI en medios de cultivo celulares saturados de EVs. Además, los complejos permanecieron atrapados en endosomas intracelulares a altas densidades celulares (HCD), impidiendo una transfección exitosa. La eficiencia de transfección pudo restaurarse cuando se eliminaban las EVs del medio gastado. Finalmente, la sobreexpresión de la UDP-glucosa ceramida glucosil-transferasa (UGCG) alivió el secuestro intracelular de los complejos y mejoró la eficiencia de transfección. El segundo capítulo de esta tesis se centró en el estudio de la mecánica celular que interrumpía la estabilidad de los complejos DNA/PEI en HCD. Se llevó a cabo una investigación sobre las vías de absorción de los complejos, resultando en una caracterización del mecanismo de transfección basado en PEI. El análisis elemental de los complejos incubados en medio gastado reveló un aumento sustancial en su fuerza iónica. Además, se adsorbió azufre en estas condiciones, lo que sugiere la acumulación de moléculas que contienen azufre en el medio extracelular. La elevada fuerza iónica resultó en la agregación de los complejos. La elucidación de los mecanismos de transfección se logró mediante la inhibición y el marcaje de proteoglicanos (PGs) específicos de la superficie celular. La absorción de los complejos parecía iniciarse por un fenómeno de coalescencia de proteoglicanos de sulfato de heparán (HSPGs) como Glypican – 4 (GPC-4), alrededor de los puntos de entrada. En el tercer capítulo, se realizó un estudio transcriptómico en cultivos de células HEK293. El diseño experimental permitió una comparación entre condiciones de recambio de medio (MRs), a dos densidades celulares distintas. Los efectos restaurativos de la transfección exhibidos por el medio deplecionado de EVs probablemente se atribuían a cambios en la naturaleza fisicoquímica del propio medio. El transporte núcleo-citoplásmico se detuvo y la producción de histonas se incrementó cuando se usaba el medio deplecionado de EVs. La posterior identificación proteómica del medio deplecionado de EVs reveló que las células experimentaban un estado similar a una infección que estimulaba las vías de liberación de viriones. Finalmente, se hipotetizó que la acumulación de la matriz extracelular era un factor clave en el CDE. El último capítulo se centró en la caracterización del producto, con el objetivo de establecer una evaluación rutinaria de los atributos críticos de calidad (CQAs). Las VLPs derivadas de la transfección por lotes y las producciones de expresión génica extendida (EGE) se sometieron a una serie de técnicas de caracterización. El impacto de la productividad específica en los CQAs también se estudió mediante estrategias de silenciamiento génico. Se vislumbraron diferencias en las propiedades biofísicas de las nanopartículas con la metodología empleada.

Transient gene expression (TGE) has gained interest for the manufacturing of biologics in recent years. The increasing demand in gene therapy vectors and the raise in tailored medicine require continuous improvements to cope with these growing needs. Nevertheless, the industrial implementation of TGE is vastly hindered due to the cell density effect (CDE). This cellular phenomenon poses serious limitations on the optimal cell density for an efficient TGE, thereby reducing the volumetric productivity of the bioprocess. Thus, the commercial exploitation of many TGE-based biopharmaceuticals is severely restricted, if not unfeasible. This PhD thesis explores the cell biology mechanisms underlying the CDE upon the production of human immunodeficiency virus (HIV-1) virus-like particles (VLPs) in HEK293 cells using polyethyleneimine (PEI)-based transfection. These VLPs are viral-derived nanostructures devoid of any genetic material that may initiate an infectious cycle. In the first chapter, the relationship between extracellular vesicles (EVs) and the CDE was studied. Initial observations proved the disruption of DNA/PEI polyplexes in EV-saturated cell culture media. Also, polyplexes remained trapped in intracellular endosomes at high cell densities (HCD), preventing successful transfection. Transfection efficiency could be restored when EVs were depleted from the exhausted media. Finally, overexpression of the UDP-glucose ceramide glucosyltransferase (UGCG) alleviated intracellular polyplex sequestration and enhanced transfection efficiency. The second chapter of this thesis was focused on the study of the cellular mechanics that disrupted DNA/PEI polyplex stability at HCD. Moreover, an investigation upon polyplex uptake pathways was undertaken, resulting in a characterization of the PEI-based transfection mechanism. Elemental analysis of polyplexes incubated in exhausted media revealed a substantial increase in their ionic strength. Additionally, sulfur was adsorbed in these conditions, suggesting the accumulation of sulfur-containing molecules in the extracellular media. The elevated ionic strength resulted in polyplex aggregation, hindering efficient cell transfection. Elucidation of the transfection mechanisms was achieved through the inhibition and labeling of specific cell-surface proteoglycans (PGs). Polyplex uptake seemed to be initiated by a coalescence phenomenon of heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) like Glypican – 4 (GPC-4) around the entry points. In the third chapter, a transcriptomic study upon HEK293 cell cultures was conducted. The experimental set-up allowed a comparison between conditions under diverse media replacement (MRs) regimes, at two distinct cell densities. The transfection restorative effects exhibited by the EV-depleted media were most likely attributed to changes in the physicochemical nature of the media. Likewise, nucleocytoplasmic transport was shut down and histone production was enhanced under EV-depleted regime. Subsequent proteomic identification of the EV-depleted media revealed that cells underwent an infection-like state that stimulated virion release pathways. Finally, extracellular matrix accumulation was hypothesized to be a key factor in the CDE. The last chapter was focused on product characterization, aiming to stablish a routinary assessment of critical quality attributes (CQAs). VLPs derived from batch transfection and extended gene expression (EGE) productions were isolated and subjected to a series of characterization techniques. Moreover, the impact of specific productivity upon CQAs was also studied by gene silencing strategies. Differences in the biophysical properties of produced nanoparticles were envisioned with the employed pipeline.