Mining the Secreted Microproteome for Novel Regulators of Intercellular Communication in Pancreatic Cancer

Abstract

Després de la seqüenciació del genoma humà, gairebé el 99% va ser descartat com a "ADN escombraria". No obstant això, al llarg dels anys, aquesta teoria ha estat desbancada. La seqüenciació de transcriptomes a gran escala va revelar que la majoria de l'ADN es transcriu en transcrits d'ARN, molts dels quals van ser inicialment anotats com no codificants. Més recentment, els avenços tecnològics en biologia computacional, peptidómica i ‘Ribo-Seq’ han revelat que molts d'aquests transcrits en realitat contenen marcs de lectura oberts no canònics que codifiquen per petites proteïnes funcionals, anomenades microproteïnes. Ara com ara només s'ha caracteritzat la funció d'una petita part d'elles, però sabem que exerceixen papers importants en la regulació de molts processos biològics. En càncer, les microproteïnes semblen regular la majoria dels seus aspectes fonamentals. Aquests descobriments han obert una nova frontera en la recerca, amb milers de microproteïnes encara per descobrir i caracteritzar, de les quals moltes podrien tenir potencial clínic. Un aspecte poc explorat de la biologia de les microproteïnes és el seu paper com a missatgers extracelul·lars. Els tumors exploten el procés de comunicació intercel·lular per a afavorir la seva progressió, ja sigui de manera local, amb el seu estroma, o a llarga distància amb llocs de futures metàstasis. Aquesta comunicació pot ser a través de la secreció de factors solubles o vesícules extracelul·lars. S'ha demostrat que els exosomes, un tipus de petites vesícules extracelul·lars d'origen endosomal, participen en la regulació del creixement tumoral, la metàstasi, l'angiogènesi i la resistència a la teràpia. En aquesta tesi doctoral, plantegem la hipòtesi que els tumors es comuniquen a través de microproteïnes secretades, ja sigui com a factors solubles lliures o empaquetades en petites vesícules extracelul·lars (pVEs). Ens vam centrar en adenocarcinoma de pàncrees (PDAC en anglès), un tipus de càncer altament mortal caracteritzat per un dens estroma que promou la progressió tumoral. Utilitzant proteòmica en explants de 9 pacients amb PDAC, vam identificar 565 microproteïnes secretades en pVEs per tumors de PDAC. Aquestes noves microproteïnes són codificades per regions del genoma prèviament considerades no codificants, com a ARN llargs no codificants (‘lncRNAs’), pseudogens o regions no traduïdes d'ARN missatgers (‘UTRs’). Sorprenentment, les nostres anàlisis suggereixen que algunes d'aquestes microproteïnes tenen potencial com a biomarcadors per al diagnòstic i el pronòstic del PDAC. També vam mostrar que les microproteïnes secretades pel tumor en pVE arriben al torrent sanguini i que el perfil de microproteïnes en plasma pot distingir entre individus sans i pacients amb PDAC. Per a explorar la funció d'aquestes microproteïnes secretades per PDAC en pVEs, vam selecionar 23 microproteïnes candidates, que van ser prioritzades per la seva estabilitat i detecció en pVE per a finalment seleccionar 3 microproteïnes principals, C9, C13 i C18, les tres induïdes per estrès i enriquides en PDAC. Utilitzant models de guany de funció in vitro i in vivo per a estudiar el paper d'aquestes 3 microproteïnes en el creixement i la metàstasi del PDAC. Les nostres dades suggereixen que C9 i C13 promouen la metàstasi mitjançant la inducció de la resposta a proteïnes mal plegades (‘UPR’ en anglès) o mitjançant la inducció de propietats mesenquimals, respectivament. La microproteïna C18 participa en la comunicació paracrina entre les cèl·lules de PDAC i els fibroblasts associats al càncer per a induir en els últims la transició d'un fenotip de miofibroblasto (myCAF) a inflamatori (iCAF). Aquest treball aporta evidència pionera que el microproteoma és una font inexplorada de missatgers extracelul·lars amb funcions essencials per a la progressió tumoral i la metàstasi. Aquestes noves microproteïnes tenen el potencial de convertir-se en els tant necessitats biomarcadors per al diagnòstic i pronòstic del càncer, així com en dianes terapèutiques.

Tras la secuenciación del genoma humano, casi el 99% de ese genoma fue descartado como "ADN basura". Sin embargo, a lo largo de los años, esta teoría ha sido desbancada. La secuenciación de transcriptomas a gran escala reveló que la mayoría del ADN se transcribe en transcritos de ARN, muchos de los cuales fueron inicialmente anotados como no codificantes. Más recientemente, los avances tecnológicos en biología computacional, peptidómica y ‘Ribo-Seq’ han revelado que muchos de estos transcritos en realidad contienen marcos de lectura abiertos no canónicos que codifican por pequeñas proteínas funcionales, llamadas microproteínas. Aunque por ahora sólo se ha caracterizado la función de una pequeña parte de ellas, sabemos que desempeñan papeles importantes en la regulación de muchos procesos biológicos. En cáncer, las microproteínas parecen regular la mayoría, si no todos, de sus aspectos fundamentales. Estos descubrimientos han abierto una nueva frontera en la investigación, con miles de microproteínas aún por descubrir y caracterizar, de las cuales muchas podrían tener potencial clínico. Un aspecto poco explorado de la biología de las microproteínas es su papel como mensajeros extracelulares. Los tumores explotan el proceso de comunicación intercelular para favorecer su progresión, ya sea de forma local, con su estroma, o a larga distancia con sitios de futuras metástasis. Esta comunicación puede ser a través de la secreción de factores solubles o vesículas extracelulares. Se ha demostrado que los exosomas, un tipo de pequeñas vesículas extracelulares de origen endosomal, participan en la regulación del crecimiento tumoral, la metástasis, la angiogénesis y la resistencia a la terapia. En esta tesis doctoral, nos planteamos la hipótesis de que los tumores se comunican a través de microproteínas secretadas, ya sea como factores solubles libres o empaquetadas en pequeñas vesículas extracelulares (pVEs). Elegimos centrarnos en adenocarcinoma de páncreas (PDAC en inglés), un tipo de cáncer altamente mortal caracterizado por un denso estroma que promueve la progresión tumoral. Utilizando proteómica en explantes de 9 pacientes con PDAC, identificamos 565 microproteínas secretadas en pVEs por tumores de PDAC. Estas nuevas microproteínas son codificadas por regiones del genoma previamente consideradas no codificantes, como ARN largos no codificantes (‘lncRNAs’), pseudogenes o regiones no traducidas de ARN mensajeros (‘UTRs’). Sorprendentemente, nuestros análisis sugieren que algunas de esas microproteínas tienen potencial como biomarcadores para el diagnóstico y el pronóstico del PDAC. También mostramos que las microproteínas secretadas por el tumor en pVE llegan al torrente sanguíneo y que el perfil de microproteínas en plasma puede distinguir entre individuos sanos y pacientes con PDAC. Para explorar la función de estas microproteínas secretadas por PDAC en pVEs, seleccionamos 23 microproteínas candidatas, que fueron cribadas por su estabilidad y detección en pVE para finalmente seleccionar 3 microproteínas principales, C9, C13 y C18, las tres inducidas por estrés y enriquecidas en PDAC. Utilizamos modelos de ganancia de función in vitro e in vivo para estudiar el papel de estas 3 microproteínas en el crecimiento y la metástasis del PDAC. Nuestros datos sugieren que C9 y C13 promueven la metástasis mediante la inducción de la respuesta a proteínas mal plegadas (‘UPR’ en inglés) o mediante la inducción de propiedades mesenquimales, respectivamente. La microproteína C18 participa en la comunicación paracrina entre las células de PDAC y los fibroblastos asociados al cáncer para inducir en los últimos la transición de un fenotipo de miofibroblasto (myCAF) a inflamatorio (iCAF). Este trabajo aporta evidencia pionera de que el microproteoma es una fuente inexplorada de mensajeros extracelulares con funciones esenciales para la progresión tumoral y la metástasis. Estas novedosas microproteínas tienen el potencial de convertirse en los tan necesitados biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico del cáncer, así como en dianas terapeúticas.

Following the completion of human genome sequencing in the early 2000's, about 99% of the genome was dismissed as "junk DNA" for presumably bearing no function. However, this assumption, along with others, has been challenged over the years. Large-scale transcriptomics analyses first revealed that most of the DNA is transcribed into RNA transcripts, many of which were initially annotated as non-coding. More recent advances in computational biology, peptidomics and ribosome profiling have uncovered a myriad of non-canonical open reading frames (ncORFs), mostly small, within these presumed non-coding regions that code for bioactive proteins, called microproteins, micropeptides or small ORF-encoded peptides (SEPs). Although only a subset of them have been functionally characterized, we now know that they play crucial roles in regulating a wide array of fundamental biological processes. In cancer, specifically, microproteins appear to regulate most, if not all, tumor hallmarks. These discoveries have opened a new frontier in research, with thousands of microproteins yet to be discovered and characterized, holding significant clinical potential. An underexplored aspect of microprotein biology is their role as secreted messengers. Tumors exploit cell-to-cell communication through soluble factors or extracellular vesicles to fuel their progression, both within the primary site between tumor cells and their surrounding stroma or with distant sites of future metastasis. Exosomes, a type of small extracellular vesicles with endosomal origin, have been shown to participate in regulating tumor growth, metastasis, immunity, angiogenesis and therapy resistance. In this doctoral thesis, we hypothesized that tumor communication is in part mediated by secreted microproteins, either as soluble factors or packaged in exosomes (or small extracellular vesicles, sEVs). We focused on pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), a devastating disease characterized by a dense desmoplastic stroma that sustains tumor growth. Employing proteomics in tissue explants derived from 9 PDAC patients, we identified 565 novel microproteins secreted in sEVs by PDAC tumors. These newly discovered microproteins are encoded by regions of the genome previously deemed non-coding such as long noncoding RNAs (lncRNAs), pseudogenes or mRNA Untranslated Regions (UTRs). Remarkably, some of these microproteins showed potential as biomarkers for PDAC diagnosis and prognosis. We also show that tumor-derived EV microproteins reach the bloodstream and that the plasma EV microproteome can distinguish PDAC patient samples from healthy donor samples. To explore the functionality of these EV secreted microproteins in PDAC, we shortlisted 23 microprotein candidates. We screened them for stable intracellular overexpression and sEV secretion in PDAC cell lines, and eventually selected 3 top microproteins, namely C9, C13 and C18, all enriched in PDAC compared to healthy pancreas and all regulated by various types of stresses. We used gain-of-function in vitro and in vivo models to study the role of these 3 EV-secreted microproteins in PDAC growth and metastasis. Our results suggest that C9 and C13 microproteins promote PDAC metastasis by enhancing the unfolded protein response and by promoting mesenchymal traits in tumor cells, respectively. C18 microprotein participates in the paracrine communication from PDAC cells to cancer-associated fibroblasts (CAFs) to promote a myCAF-to-iCAF phenotype switch. Lastly, we interrogated the soluble fraction of plasma from PDAC patients by proteomics and identified hundreds of secreted soluble microproteins, which warrants further functional studies.Our findings provide pioneering evidence that the microproteome is a critically unexplored source of extracellular messengers in cancer, with essential functions in tumor progression, and could serve as much-needed biomarkers for cancer diagnosis or prognosis, as well as therapeutic targets in oncology.