Production of Biostimulant and Biopesticide through Solid- State Fermentation Using Green Waste

Abstract

Aquesta tesi se centra en l'ús de la fermentació en estat sòlid (FES) com un enfocament per produir bioestimulants i biopesticides a partir de residus verds. En la investigació es van utilitzar residus verds, incloent restes gespa i poda d'arbres del campus de la UAB, com a substrats. Es va utilitzar Trichoderma harzianum com a inòcul per produir el bioestimulant àcid indol-3-acètic (IAA) i el biopesticida en forma d'espores conidials mitjançant FES. La primera part dels resultats correspon a les proves preliminars per validar i optimitzar el procés. Els experiments en aquest capítol es van realitzar utilitzant reactors de llit empacat de 0.5 L. Inicialment, es va avaluar la viabilitat de la FES utilitzant T.harzianum per produir IAA i espores en residus de gespa i poda. Posteriorment, es van analitzar diversos paràmetres, inclosos les proporcions de residu de gespa i poda, el contingut d'humitat i la concentració de triptòfan (utilitzat com a precursor de la producció d'IAA a la FES), per desenvolupar un model que optimitzés la producció simultània d'IAA i espores. A més, es van investigar els efectes de la temperatura i el temps de fermentació en l' obtenció dels bioproductes objecte d' estudi. Els experiments mitjançant un seguiment al llarg del temps del procés, van revelar que la producció màxima d'IAA va tenir lloc el dia 3 de fermentació, assolint 101.4 µg g⁻¹ MS, mentre que la producció d'espores va assolir el seu pic el dia 7 amb 3.0×10⁹ espores g⁻¹ MS. La segona part dels resultats, centrant-se en la FES per a la producció d'IAA i amb un reactor de llit empacat de 22 L, també explorant l’operació del reactor en mode de lots seqüencials com a estratègia d’operació. El procés es va realitzar sota les mateixes condicions establertes per al reactor de 0.5 L. No obstant això, els resultats preliminars de la FES a escala de 22 L van indicar que el residus de poda no eren un agent estructurant adequat, ja que no proporcionaven la porositat suficient i a més a més era més propens a la contaminació. En canvi, la substitució dels residus de poda per encenalls de fusta com a agent estructurant va augmentar la porositat a gairebé el 70%, la qual cosa va millorar substancialment la productivitat, amb la producció d' IAA i espores arribant a assolir els valors de 119.9 µg g⁻¹ MS y 1.3×10⁹ esporas g⁻¹ MS, respectivamente. Aquestes troballes suggereixen que la porositat és un factor crític en el rendiment de la SSF a escales majors. Per la seva banda, l'ús de l'estratègia de lot seqüencial no va tenir èxit, cosa que ressalta la necessitat de noves estratègies per reduir els problemes de contaminació derivats de treballar amb residus reals i heterogenis. La tercera part dels resultats presenta els resultats de la producció d'IAA i conidis en un reactor de safates. En aquesta configuració, la producció d' IAA va assolir 201.3 µg g⁻¹ MS, valor superior als nivells assolidor en el reactor de llit empacat de 22 L. La producció màxima de conidis al reactor de safates va ser de 1.1 × 10⁹ esporas g⁻¹ MS. Es va observar certa variabilitat en els resultats entre les repeticions de les fermentacions. Per comprendre millor aquesta variabilitat, es va utilitzar una anàlisi de components principals (PCA) per examinar la relació entre els paràmetres clau del procés. L'anàlisi va revelar que la temperatura estava relacionada amb els nivells finals d'IAA. Com a resultat, es va desenvolupar una estratègia de procés basada en un règim de temperatura baixa per prevenir la degradació d'IAA i millorar la seva producció.

Esta tesis se centra en el uso de la fermentación en estado sólido (FES) como un enfoque para producir bioestimulantes y biopesticidas a partir de residuos verdes. En la investigación se utilizaron residuos verdes, incluyendo restos de césped y poda de árboles del campus de la UAB, como sustratos. Se usó Trichoderma harzianum como inóculo para producir el bioestimulante ácido indol-3-acético (IAA) y el biopesticida en forma de esporas conidiales mediante FES. La primera parte de los resultados corresponde a las pruebas preliminares para validar y optimizar el proceso. Los experimentos en este capítulo se realizaron utilizando reactores de lecho empacado de 0.5 L. Inicialmente, se evaluó la viabilidad de la FES utilizando T.harzianum para producir IAA y esporas en residuos de césped y poda. Posteriormente, se analizaron diversos parámetros, incluidos las proporciones de residuo de césped y poda, el contenido de humedad y la concentración de triptófano (el precursor de la producción de IAA), para desarrollar un modelo que optimizara la producción simultánea de IAA y esporas. Además, se investigaron los efectos de la temperatura y el tiempo de fermentación en la obtención de los bioproductos objeto de estudio. Los experimentos mediante un seguimiento a lo largo del tiempo del proceso, revelaron que la producción máxima de IAA tuvo lugar el día 3 de fermentación, alcanzando 101.4 µg g⁻¹ MS, mientras que la producción de esporas alcanzó su pico el día 7 con 3.0×10⁹ esporas g⁻¹ MS. La segunda parte de los resultados, centrándose en la FES para la producción de IAA y conidios a bench scale utilizando un reactor de lecho empacado de 22 L, y también explorando la operación del reactor en modo de lotes secuenciales como estrategia de operación. El proceso se realizó bajo las mismas condiciones establecidas para el reactor de 0.5 L. Sin embargo, los resultados preliminares de la FES a escala de 22 L indicaron que los residuos de poda no eran un agente estructurante adecuado, ya que no proporcionaban la porosidad suficiente y eran más propensos a la contaminación. En cambio, la sustitución de los residuos de poda por virutas de madera como agente estructurante aumentó la porosidad a casi el 70%, lo que mejoró sustancialmente la productividad, con la producción de IAA y esporas elevándose a 119.9 µg g⁻¹ MS y 1.3×10⁹ esporas g⁻¹ MS, respectivamente. Estos hallazgos sugieren que la porosidad es un factor crítico en el rendimiento de la SSF a escalas mayores. Por su parte, el uso de la estrategia de lote secuencial no tuvo éxito, lo que resalta la necesidad de nuevas estrategias para reducir los problemas de contaminación derivados de trabajar con residuos reales y heterogéneos. La tercera parte de los resultados presenta los resultados de la producción de IAA y conidios en un reactor de bandejas. En esta configuración, la producción de IAA alcanzó 201.3 µg g⁻¹ MS, valor superior a los niveles alcanzador en el reactor de lecho empacado de 22 L. La producción máxima de conidios en el reactor de bandejas fue de 1.1 × 10⁹ esporas g⁻¹ MS. Se observó cierta variabilidad en los resultados entre las repeticiones de las fermentaciones. Para comprender mejor esta variabilidad, se utilizó un análisis de componentes principales (PCA) para examinar la relación entre los parámetros clave del proceso. El análisis reveló que la temperatura estaba relacionada con los niveles finales de IAA. Como resultado, se desarrolló una estrategia de proceso basada en un régimen de temperatura baja para prevenir la degradación de IAA y mejorar su producción.

This thesis focuses on the use solid state fermentation (SSF) as an approach to produce plant biostimulant and biopesticide using green waste. The research utilized green waste, including grass clippings and tree pruning collected from the UAB campus, as substrates. Trichoderma harzianum was used as the inoculum to produce the biostimulant indole-3-acetic acid (IAA) and the biopesticide in the form of conidial spores through SSF. The first part of the results corresponds to the preliminary tests to validate and optimize the process. Experiments in this chapter were conducted using 0.5 L packed bed reactors. Initially, the feasibility of SSF using T.harzianum to produce IAA and spores on grass and pruning waste was assessed. Subsequently, various parameters, including the proportions of grass and pruning waste, moisture content, and tryptophan concentration (as the precursor of IAA production in the SSF) were analyzed to develop a model for optimizing the simultaneous production of IAA and spores. The model's optimized conditions were grass content at 56% and pruning waste at 44% of dry matter (DM), moisture at 74%, and tryptophan (Trp) concentration at 0.43% (w/w). Additionally, the effects of temperature and fermentation time on bioproducts obtention were investigated. The time-course experiments revealed that maximum IAA production occurred on day 3 of fermentation, reaching 101.4 µg g⁻¹ DM, while spore production peaked on day 7 at 3.0×10⁹ spores g⁻¹ DM. The second part of the results focused on SSF for the production of IAA and conidia at bench scale using a 22 L packed bed reactor, and also exploring the use of a sequential batch reactor (SBR) as an operational strategy. The process was conducted under the same conditions established for the 0.5 L reactor. However, preliminary SSF results at the 22 L scale indicated that pruning waste was not a suitable bulking agent, as it failed to provide adequate porosity. Substituting pruning waste with wood chips as a bulking agent increased porosity to nearly 70%, which substantially improved productivity, with IAA and spore production rising to 119.9 µg g⁻¹ DM and 1.3×10⁹ spores g⁻¹ DM, respectively. These findings suggest that porosity is a critical factor in SSF performance at larger scales. Additionally, the use of the sequential batch strategy was unsuccessful, highlighting the need for new strategies to reduce contamination issues arising from the use of real waste and the complex composition of green waste. The third part of the results presents the outcome of IAA and conidia production in the tray bioreactor. In this configuration, IAA production reached 201.3 µg g⁻¹ DM, which is higher than the levels achieved in the 22 L packed bed reactor. The maximum conidia production in the tray bioreactor was 1.1 × 10⁹ spores g⁻¹ DM. A comparison between the tray and 22 L bioreactors suggested that the tray bioreactor is a more advantageous configuration for fungal SSF biostimulant production using green waste, due to the different aeration system in the tray setup. However, there was variability in the results between experiments carried out under same conditions. To better understand this variability, principal component analysis (PCA) was used to examine the relationship between key process parameters. The analysis revealed that the temperature, particularly in the latter stages of the process, was related to the final IAA levels. As a result, a process strategy was developed based on a low temperature regimen to prevent IAA degradation and enhance production. Overall, the outcome of this thesis represents a new approach to valorize GW to produce biostimulant and biopesticide agents in the framework of circular bioeconomy.