Molecularly Imprinted Polymers targeting small labels for biomolecular design and their integration into Paper-Based Diagnostic Platforms

Abstract

Aquesta tesi doctoral explora la integració de polímers d'impressió molecular (MIPs) en diverses plataformes de diagnòstic. Els MIPs són materials sintètics dissenyats per imitar les capacitats de reconeixement de les molècules biològiques, com els anticossos, però amb més estabilitat, menor cost i producció escalable sense l'ús d'animals. L'objectiu principal d'aquesta tesi és el disseny de MIPs específics per a etiquetes moleculars petites, incloent-hi biotina (BIO), digoxigenina (DIG) i 6-carboxifluoresceïna (6-FAM), que són comunament utilitzades en assajos biològics i proves de diagnòstic. Aquestes etiquetes proporcionen arquitectures biomoleculars versàtils que permeten sistemes de detecció flexibles per a una àmplia gamma d'anàlits, millorant l'adaptabilitat diagnòstica en diverses aplicacions. Inicialment, es van sintetitzar MIPs específics per a biotina i es van integrar en assajos de flux lateral d'àcids nucleics (NALF). Aquesta integració va demostrar millores significatives en els assajos de flux lateral en comparació amb els receptors biològics convencionals en termes d'estabilitat, mantenint alhora una excel·lent sensibilitat. A més, el treball es va ampliar per incloure la síntesi de MIPs per a les etiquetes DIG i 6-FAM, utilitzant modelatge computacional in silico, cosa que va optimitzar el procés de polimerització i els recursos necessaris. Els MIPs resultants es van integrar amb èxit en plataformes de diagnòstic, inclosos sistemes multiplexats de NALF capaços de detectar múltiples anàlits d'ADN amb doble etiqueta de manera simultània. L'ús d'aquestes tres etiquetes —biotina, DIG i 6-FAM— va permetre la creació de sistemes de diagnòstic personalitzables i multiplexats, destacant la flexibilitat i l'adaptabilitat de les arquitectures biomoleculars basades en MIPs per a diversos assajos biològics. Una altra contribució clau d'aquesta tesi és l'exploració de MIPs en assajos no convencionals de flux vertical d'àcids nucleics (NAVF). Els sistemes NAVF ofereixen avantatges com temps d'assaig més ràpids i la capacitat de processar volums de mostra més grans. L'anàlisi comparativa entre NAVF i NALF va mostrar que NAVF és més adequat per a aplicacions en què la detecció qualitativa immediata és essencial, mentre que NALF segueix sent òptim per a detectar concentracions baixes d'analits en assajos més sensibles i quantificables. Finalment, també s'exploren la síntesi i integració de MIPs magnètics (m-MIPs) en plataformes diagnòstiques magneto-actuades. Aquests sistemes utilitzen la separació magnètica per millorar la robustesa i sensibilitat dels assajos, especialment en matrius de mostres complexes. Els m-MIPs es van incorporar en plataformes magneto-actuades amb lectures òptiques i electroquímiques, incloent-hi un dispositiu electroquímic portàtil operat per bateries, demostrant el potencial per a proves en el punt d'atenció en entorns amb recursos limitats. En conjunt, aquesta tesi destaca la versatilitat de les arquitectures biomoleculars basades en MIPs centrades en etiquetes moleculars petites com biotina, DIG i 6-FAM. La capacitat d'adaptar aquestes etiquetes en múltiples plataformes —flux lateral, flux vertical i sistemes magneto-actuats electroquímics i òptics— demostra el seu potencial per contribuir a la millora del diagnòstic en el punt d'atenció, proporcionant alta sensibilitat, especificitat i adaptabilitat per a una àmplia gamma de necessitats diagnòstiques. La integració exitosa dels MIPs en aquestes plataformes obre el camí per a futurs avenços, incloent-hi el desenvolupament de sistemes diagnòstics en el punt d'atenció que incloguin un dispositiu de PCR portàtil operat per bateries, combinat amb un prototip de prova ràpida basada en paper que integri MIPs. Aquest sistema té el potencial de ser utilitzat per al cribratge tant de malalties transmissibles com no transmissibles, on la PCR és l'estàndard de referència, que permet un diagnòstic precís directament en entorns de recursos limitats.

Esta tesis doctoral explora la integración de polímeros de impresión molecular (MIPs) en diversas plataformas de diagnóstico. Los MIPs son materiales sintéticos diseñados para imitar las capacidades de reconocimiento de las moléculas biológicas, como los anticuerpos, pero con mayor estabilidad, menor coste y producción escalable sin el uso de animales. El objetivo principal de esta tesis es el diseño de MIPs específicos para etiquetas moleculares pequeñas, incluyendo biotina (BIO), digoxigenina (DIG) y 6-carboxifluoresceína (6-FAM), que son comúnmente utilizadas en ensayos biológicos y pruebas de diagnóstico. Estas etiquetas proporcionan arquitecturas biomoleculares versátiles que permiten sistemas de detección flexibles para una amplia gama de analitos, mejorando la adaptabilidad diagnóstica en diversas aplicaciones. Inicialmente, se sintetizaron MIPs específicos para biotina y se integraron en ensayos de flujo lateral de ácidos nucleicos (NALF). Esta integración demostró mejoras significativas en los ensayos de flujo lateral en comparación con los receptores biológicos convencionales en términos de estabilidad, manteniendo al mismo tiempo una excelente sensibilidad. Además, el trabajo se amplió para incluir la síntesis de MIPs para las etiquetas DIG y 6-FAM, utilizando modelado computacional in silico, lo que optimizó el proceso de polimerización y los recursos necesarios. Los MIPs resultantes se integraron con éxito en plataformas de diagnóstico, incluidos sistemas multiplexados de NALF capaces de detectar múltiples analitos de ADN con doble etiqueta de manera simultánea. El uso de estas tres etiquetas —biotina, DIG y 6-FAM— permitió la creación de sistemas de diagnóstico personalizables y multiplexados, destacando la flexibilidad y adaptabilidad de las arquitecturas biomoleculares basadas en MIPs para diversos ensayos biológicos. Otra contribución clave de esta tesis es la exploración de MIPs en ensayos no convencionales de flujo vertical de ácidos nucleicos (NAVF). Los sistemas NAVF ofrecen ventajas como tiempos de ensayo más rápidos y la capacidad de procesar volúmenes de muestra más grandes. El análisis comparativo entre NAVF y NALF mostró que NAVF es más adecuado para aplicaciones en las que la detección cualitativa inmediata es esencial, mientras que NALF sigue siendo óptimo para detectar concentraciones bajas de analitos en ensayos más sensibles y cuantificables. Finalmente, también se exploran la síntesis e integración de MIPs magnéticos (m-MIPs) en plataformas diagnósticas magneto-actuadas. Estos sistemas utilizan la separación magnética para mejorar la robustez y sensibilidad de los ensayos, particularmente en matrices de muestras complejas. Los m-MIPs se incorporaron en plataformas magneto-actuadas con lecturas ópticas y electroquímicas, incluyendo un dispositivo electroquímico portátil operado por baterías, demostrando el potencial para pruebas en el punto de atención en entornos con recursos limitados.

En conjunto, esta tesis destaca la versatilidad de las arquitecturas biomoleculares basadas en MIPs centradas en etiquetas moleculares pequeñas como biotina, DIG y 6-FAM. La capacidad de adaptar estas etiquetas en múltiples plataformas —flujo lateral, flujo vertical, y sistemas magneto-actuados electroquímicos y ópticos— demuestra su potencial para contribuir en la mejora del diagnóstico en el punto de atención, proporcionando alta sensibilidad, especificidad y adaptabilidad para una amplia gama de necesidades diagnósticas. La integración exitosa de los MIPs en estas plataformas abre el camino para futuros avances, incluidos el desarrollo de sistemas diagnósticos en el punto de atención que incluyan un dispositivo de PCR portátil operado por baterías, combinado con un prototipo de prueba rápida basada en papel integrando MIPs. Este sistema tiene el potencial de ser utilizado para el cribado tanto de enfermedades transmisibles como no transmisibles, donde la PCR es el estándar de referencia, permitiendo un diagnóstico preciso directamente en entornos de recursos limitados.

This doctoral thesis explores the integration of Molecularly Imprinted Polymers (MIPs) into various diagnostic platforms. MIPs are synthetic materials designed to mimic the recognition capabilities of biological molecules, such as antibodies, but with greater stability, cost-effectiveness, and scalable, animal-free production. The primary focus of this thesis is the design of MIPs specific to small molecular tags, including biotin (BIO), digoxigenin (DIG), and 6-carboxyfluorescein (6-FAM), which are commonly used in biological and diagnostic assays. These molecular tags provide versatile biomolecular architectures that enable flexible detection systems for a wide range of targets, enhancing diagnostic adaptability across diverse applications. Initially, biotin-specific MIPs were synthesized and integrated into nucleic acid lateral flow (NALF) assays. This integration demonstrated significant improvements in lateral flow assays compared to conventional biological receptors in terms of stability while maintaining excellent sensitivity. Furthermore, the work expanded to include the synthesis of MIPs for DIG and 6-FAM labels, using in silico computational modeling, which optimized the polymerization process. The resulting MIPs were successfully integrated into diagnostic platforms, including multiplexed NALF systems capable of detecting multiple double-tagged DNA targets simultaneously. The use of these three tags—biotin, DIG, and 6-FAM—enabled the creation of customizable and multiplexed diagnostic systems, highlighting the flexibility and adaptability of MIP-based biomolecular architectures for various biological assays. Another key contribution of this thesis is the exploration of MIPs in non-conventional, paper-based nucleic acid vertical flow (NAVF) assays. NAVF systems offer advantages such as faster assay times and the ability to process larger sample volumes. The comparative analysis between NAVF and NALF showed that NAVF is better suited for applications where immediate, qualitative detection is essential, while NALF remains optimal for detecting low analyte concentrations in more sensitive, quantifiable assays. Finally, the synthesis and integration of magnetic MIPs (m-MIPs) into magneto-actuated diagnostic platforms are also explored. These systems used magnetic separation to enhance assay robustness and sensitivity, particularly in complex sample matrices. The m-MIPs were incorporated into magneto-actuated platforms with optical and electrochemical readouts, including a portable electrochemical device operated by batteries, demonstrating the potential for point-of-care testing in resource-limited settings. Overall, this thesis highlights the versatility of MIP-based biomolecular architectures centered on small molecular labels like biotin, DIG, and 6-FAM. The ability to adapt these tags across multiple platforms—lateral flow, vertical flow, and electrochemical and optical magneto-actuated systems—demonstrates their potential to advance point-of-care diagnostics by providing high sensitivity, specificity, and adaptability for a wide range of diagnostic needs. The successful integration of MIPs into these platforms paves the way for future advancements, including the development of point-of-care diagnostic systems featuring a portable, battery-operated end-point PCR device, combined with a paper-based RDT prototype utilizing MIPs. This system holds the potential to screen both communicable and non-communicable diseases, for which PCR is the gold standard, enabling accurate diagnosis directly in low-resource settings.