Development of reactors with immobilized fungal biomass for the degradation of organophosphate flame retardants in effluents

Abstract

L'aparició persistent de retardants de flama d'organofosfats (OPFRs) en els efluents d'aigües residuals posa de manifest les limitacions dels tractaments convencionals per a la seva eliminació efectiva. En resposta, el tractament mitjançant fongs de podridura blanca (WRF) és una solució prometedora degut al seu sistema enzimàtic robust, capaç de degradar diversos contaminants.

La present tesi doctoral pretén desenvolupar un tractament basat en fongs per a l'eliminació de cinc OPFRs: tri-n-butil fosfat (TBP), tris (2-butoxietil) fosfat (TBEP), tris (2-cloroetil) fosfat ( TCEP), tris(2-cloropropil) fosfat (TCPP) i trietil fosfat(TEP) de les aigües residuals urbanes (UWW). Això es farà mitjançant l'ús de bioreactors amb WRF immobilitzats i en condicions no estèrils.

Inicialment, es va desenvolupar un mètode analític per a un seguiment ràpid de les concentracions d'aquests contaminants, tenint en compte els efectes de la matriu. A continuació, es van seleccionar uns fongs candidats en funció de la seva eficiència en l’assimilació d’una fonts de carboni menys fàcilment assimilable (acetat) i l'eliminació d'OPFRs per un grup de fongs WRF i Ascomycota. Tots els fongs van assimilar l'acetat, però els WRF van superar els fongs Ascomycota en l'eliminació d'OPFRs. Els compostos clorats eren més difícils d'eliminar i la polaritat de l'OPFR es correlacionava inversament amb la seva susceptibilitat a la degradació per fongs. A més, es va identificar que el sistema intracel·lular CYP450 estava involucrat en la degradació dels OPFRs. Es van seleccionar tres WRF de millor rendiment: Trametes versicolor, Ganoderma lucidum i Pycnoporus sanguineus, en un enfocament de co-cultiu per al tractament de la UWW.

Els tres WRF es van emparellar amb OPFRs individuals i es van identificar productes potencials de transformació (TP). A partir d'aquestes dades, es van proposar vies de degradació, on es van identificar passos comuns mediats per CYP450, però també es van proposar mecanismes nous. També es van realitzar avaluacions de toxicitat in vivo i in silico, identificant certs TP com a potencialment tòxics.

Un dels suports utilitzats per a la immobilització dels WRF va ser la fusta, contribuint parcialment a la sorció dels OPFRs. En conseqüència, es va examinar la capacitat de T. versicolor de degradar TBP sorbit a la fusta després de múltiples cicles de sorció, com a cas estudi, per al tractament de residus de fusta del tractament de la UWW. Després de 90 dies de tractament, el fong va degradar eficaçment el TBP sorbit en residus de cada cicle. No obstant això, es va observar que un temps de tractament més extens era necessari per disminuir la toxicitat associada a TPs formats.

A partir dels coneixements adquirits, es va tractar una UWW dopada amb els OPFRs en bioreactors de tambor rotatiu (RDB) durant tres mesos. Els tres WRF seleccionats es van immobilitzar sobre fusta o àcid polilàctic (PLA). A més, es va incloure un reactor de control que només contenia fusta per avaluar la contribució de la sorció de la fusta. Els resultats van suggerir que el reactor amb suport de fusta era la millor opció per a la supervivència dels fongs i el control de la contaminació durant el tractament. Tant el TBP com el TBEP es van degradar efectivament en tots els RDBs, ja sigui per WRF o per altres microorganismes. No obstant això, G. lucidum va sorgir com a particularment important per degradar els OPFRs clorats. Els TPs potencialment tòxics es van eliminar amb èxit a llarg termini. Finalment, el post-tractament amb fongs dels residus de fusta va eliminar eficaçment els OPFRs sorbits i va reduir la toxicitat.

En general, els resultats d'aquest estudi posen de manifest el potencial d'aplicar els WRF a la degradació dels OPFR a les aigües residuals reals.

La persistente presencia de retardantes de llama organofosforados (OPFRs) en los efluentes de depuradora destaca las limitaciones de los tratamientos convencionales para su remoción efectiva. En respuesta, el tratamiento con hongos de podredumbre blanca (WRF) es una solución prometedora debido a su robusto sistema enzimático capaz de degradar diversos contaminantes.

La presente tesis doctoral tiene como objetivo el desarrollar un tratamiento basado en el uso de WRF para la eliminación de cinco OPFRs: tri-n-butilfosfato (TBP), tris(2-butoxietilo) fosfato (TBEP), tris(2-cloroetil) fosfato (TCEP), tris(2-cloropropil) fosfato (TCPP) y trietil fosfato (TEP) de aguas residuales urbanas (UWW). Esto se realizó en condiciones no estériles mediante el uso de biorreactores con WRF inmovilizados.

Inicialmente, se desarrolló un método analítico para el monitoreo rápido de las concentraciones de estos contaminantes, considerando también los efectos de las matrices utilizadas. Posteriormente, se seleccionaron los mejores candidatos de un grupo de WRF y Ascomicetos, en función de su capacidad para consumir una fuente de carbono menos asimilable (acetato) y de la eficiencia de eliminación de OPFRs. Todos los hongos consumieron el acetato, pero los WRF superaron a los Ascomicetos en la eliminación de OPFRs. Los compuestos clorados eran más difíciles de eliminar y la polaridad de los OPFRs y su susceptibilidad a ser degradados estaban inversamente correlacionados. Adicionalmente, se identificó al sistema enzimático intracelular CYP450 como responsable de la degradación de los OPFRs. Se seleccionaron tres WRF que mostraron el mejor desempeño: Trametes versicolor, Ganoderma lucidum y Pycnoporus sanguineus, en un enfoque de co-cultivo de cepas para el tratamiento de la UWW.

Los tres WRF se emparejaron con cada OPFR y se identificaron posibles productos de transformación (TPs). A partir de estos datos se propusieron rutas de degradación, donde se identificaron pasos comunes mediados por el sistema enzimático CYP450, además de mecanismos novedosos. También se llevaron a cabo análisis de toxicidad in vivo e in silico, identificando ciertos TPs como potencialmente tóxicos.

Uno de los soportes utilizados para la inmovilización de los WRF fue la madera, que contribuye parcialmente a la eliminación de OPFRs mediante sorción. Por ello, a modo de estudio de caso para el tratamiento de residuos de madera obtenidos después de tratar la UWW, se evaluó la capacidad de T. versicolor para degradar TBP sorbido en madera después de numerosos ciclos de sorción. Tras 90 días de inoculación, el hongo degradó efectivamente el TBP sorbido en los residuos de cada ciclo. Sin embargo, se observó que un tiempo de tratamiento más extenso era necesario para disminuir la toxicidad asociada a TPs formados.

En base al conocimiento adquirido, se trató la UWW dopada con OPFRs en biorreactores de tambor rotatorio (RDBs) durante tres meses. Los tres WRF seleccionados fueron inmovilizados ya sea en madera o en ácido poliláctico (PLA). Además, se incluyó un reactor de control que contenía solo madera para estudiar la contribución de ésta a la sorción de los OPFRs. Los resultados sugirieron que el reactor usando un soporte de madera era la mejor opción para la supervivencia de los WRF y el control de la contaminación durante el tratamiento. Tanto TBP como TBEP fueron efectivamente degradados en todos los RDBs, ya sea por los WRF u otros microorganismos. Sin embargo, G. lucidum resultó particularmente importante para la degradación de OPFRs clorados. Los TPs potencialmente tóxicos fueron eliminados con éxito a largo plazo. Finalmente, el post-tratamiento fúngico de los residuos de madera eliminó eficazmente los OPFRs embebidos en éstos, reduciendo la toxicidad.

En resumen, los hallazgos de este estudio destacan el potencial del uso de los WRF en la degradación de OPFRs en aguas residuales.

The persistent occurrence of Organophosphate Flame Retardants (OPFRs) in wastewater effluents highlights the limitations of conventional treatments for their effective remotion. In response, fungal treatment by white rot fungi (WRF) stands out as a promising solution due to their robust enzymatic system, capable of degrading various contaminants.

The present PhD thesis aims to develop a fungal-based treatment for the removal of five OPFRs: tri-n-butyl phosphate (TBP), tris (2-butoxy ethyl) phosphate (TBEP), tris(2-chloroethyl) phosphate (TCEP), tris(2-chloropropyl) phosphate (TCPP), and triethyl phosphate (TEP) from urban wastewater (UWW). This was done by using bioreactors with immobilized WRF under non-sterile conditions.

Initially, a simple quantification method was developed for rapid monitoring of these contaminant’s concentrations, considering matrix-effects. Next, optimal fungal candidates were screened out based on their efficiency in less assimilable carbon source (acetate) uptake and OPFRs removal from a group of WRF and Ascomycota fungi. All fungi removed acetate, but WRF outperformed Ascomycota fungi in OPFRs removal. Chlorinated compounds were more challenging to remove and OPFR polarity inversely correlated with its susceptibility to fungal degradation. Additionally, the CYP450 intracellular enzymatic system was identified as responsible for OPFRs degradation. Three top-performing WRF: Trametes versicolor, Ganoderma lucidum and Pycnoporus sanguineus were selected in a co-culture approach for UWW treatment.

The three selected WRF were paired with individual OPFRs, and potential transformation products (TPs) were identified. From these data, degradation pathways were proposed, where common CYP450-mediated steps were identified but also novel mechanisms were proposed. In vivo and in silico toxicity assessments were also conducted, identifying certain TPs as potentially toxic.

One of the supports used for WRF immobilization was wood, partially contributing to OPFRs removal by sorption. In consequence, the ability of T. versicolor to degrade TBP sorbed in wood after multiple sorption cycles was examined, as a case study for potential treatment of wood residues from UWW treatment. After 90 days of inoculation, the fungus effectively degraded the TBP sorbed in wood residues from each cycle. However, it was observed that a longer treatment time was necessary to reduce the toxicity associated with formed TPs.

Based on the gained knowledge, UWW spiked with the targeted OPFRs was treated in rotating drum bioreactors (RDBs) for three months. The three selected WRF were immobilized on either wood or polylactic acid (PLA). In addition, a control reactor containing only wood was included to assess its sorption contribution. Results suggested that the wood supported reactor was the best option for WRF survival and contamination control during treatment. Both TBP and TBEP were effectively degraded in all RDBs, either by WRF or other microorganisms. However, G. lucidum emerged as particularly important for degrading chlorinated OPFRs. Potentially toxic TPs were successfully eliminated in the long-term. Finally, fungal post-treatment of the wooden residues effectively removed embedded OPFRs and reduced toxicity.

Overall, the findings of this study highlight the potential for applying WRF on the degradation of OPFRs in real wastewater.