Biofilms microbianos: Virulencia e interacciones hongo-bacteria

Abstract

[spa] En la naturaleza la mayoría de los microorganismos viven en comunidades protegidas por una matriz extracelular. Estas agrupaciones, denominadas biofilms, generalmente albergan múltiples especies de microorganismos que interactúan entre sí. En el contexto biomédico, los biofilms se asocian con infecciones comunes, infecciones causantes de morbilidad severa e incluso infecciones causantes de mortalidad. Una vez adquiridas, estas infecciones son difíciles de erradicar, generando típicamente enfermedades recurrentes y/o crónicas. La consecuente prolongación en las hospitalizaciones genera una carga económica considerable e impacta negativamente en la calidad de vida de los pacientes. A pesar de esto, actualmente existen varias limitaciones que dificultan el manejo adecuado de las infecciones causadas por biofilms. La presente tesis estudió interacciones ambientales e inter-especies que influencian las características de los biofilms de hongos del género Candida y bacterias patógenas, siendo de particular interés aquellas relacionadas con la susceptibilidad y la virulencia. En primer lugar, se evaluó el impacto de cuatro medios de cultivo comúnmente usados en las principales características patogénicas de Candida parapsilosis. Las variaciones obtenidas en la tasa de crecimiento, morfología, susceptibilidad y virulencia asociadas al medio de cultivo resaltan el papel de las adaptaciones metabólicas en la patogenicidad de esta levadura y señalan la importancia de elegir adecuadamente las condiciones de los diseños experimentales. Luego, se estudiaron biofilms polimicrobianos de Candida albicans y Pseudomonas aeruginosa. Los resultados demuestran que el orden de colonización de las especies es un factor importante en el establecimiento de las interacciones entre estos microorganismos. En este escenario, los efectos de prioridad no sólo influencian la biomasa de las especies, sino también la estructura, susceptibilidad y virulencia del biofilm resultante. Por otra parte, el estudio de las interacciones no físicas entre C. albicans y Staphylococcus aureus permitió identificar que cambios ambientales relacionados con el pH y la disponibilidad de recursos resultan en nuevos fenotipos de S. aureus. Estas variantes presentan cambios en la expresión de factores de virulencia pertenecientes al sistema agr, que impactan negativamente la supervivencia de larvas de Galleria mellonella. I

Finalmente, conscientes de la necesidad de contar con métodos y plataformas confiables para la realización de pruebas de susceptibilidad de biofilms, se evaluó el uso de diferentes tinciones en el estudio de los biofilms de C. parapsilosis. De esta manera, se encontró que las tinciones Syto 9, Naranja de tiazol y Diacetato de fluoresceína tenían un bajo rendimiento en el marcaje de C. parapsilopsis, a diferencia de la tinción FUN-1. Adicionalmente, se diseñó un dispositivo de microfluídica para el estudio de biofilms bacterianos en condiciones dinámicas. El BiofilmChip permite la formación de biofilms partir de cepas de laboratorio, aislamientos clínicos y muestras de pacientes, proporcionando condiciones que se asemejan a las encontradas en infecciones naturales. Además, posee un método de lectura rápido y sencillo basado en la impedancia, que permite monitorear el crecimiento y los cambios de biomasa asociados a la efectividad del tratamiento. En conclusión, el presente trabajo demuestra la importancia de caracterizar las respuestas de los microorganismos que crecen en biofilms frente a variaciones ambientales, para así definir mejores protocolos para su estudio. Además, resalta la necesidad de estudiar las coinfecciones hongo-bacteria como una comunidad, donde las interacciones físicas y químicas y los efectos de prioridad pueden aumentar el potencial patogénico de los microorganismos. Esto permitirá la formación de biofilms en condiciones más realistas, lo que se traducirá en avances de conocimiento en el campo. Por último, el desarrollo conjunto de métodos para la evaluación de susceptibilidad en biofilms, brindará las herramientas necesarias para ofrecer un tratamiento con mayor probabilidad de éxito en el manejo de las infecciones.

[eng] In nature, most microorganisms live in communities protected by an extracellular matrix. These assemblies, known as biofilms, typically harbor multiple interacting species. In the biomedical context, biofilms are associated with infections that range from common to severe morbidity and even mortality. Once established, these infections are difficult to eradicate, often resulting in recurrent and/or chronic diseases. Consequently, the prolongation of hospital stays imposes a considerable economic burden and negatively impacts patients' quality of life. Despite this, several limitations currently hinder the proper management of biofilm-associated infections. This thesis studied environmental and interspecies interactions that influence the characteristics of biofilms formed by fungi of the genus Candida and clinically relevant bacteria, with particular interest in those factors related to susceptibility and virulence. First, recognizing the importance of the emergent pathogen Candida parapsilosis, culture media was identified as an important variable in biofilm formation, susceptibility, and virulence. Then, the performance of conventional fluorescent dyes for antifungal susceptibility testing of this yeast was evaluated, highlighting the necessity of optimal assessment of techniques before implementation. Second, microbial interactions between Candida albicans and the bacteria Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus were studied by two different approaches, showing that interkingdom interactions (physical, chemical and priority effects) can impact positively the virulence of co-infections. Finally, the BiofilmChip, a microfluidic device that allows the formation and susceptibility testing of bacterial biofilms through impedance readings, was designed and validated as a versatile and easy- to-implement tool. In conclusion, this work demonstrates the importance of characterizing the responses of microorganisms growing in biofilms to environmental variations to define better research protocols. Additionally, it highlights the need to study fungal-bacterial coinfections as a community, where interspecies interactions can increase the pathogenic potential of the microorganisms. Lastly, the development and validation of methods for biofilm susceptibility testing will improve the likelihood of success in managing infections.