Development of Epstein-Barr Virus-Specific T cells expressing anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor for cancer immunotherapy

Abstract

[eng] T cells expressing chimeric antigen receptors (CAR-T) targeting the CD19 antigen have been proven to be one of the most promising treatments for B cell neoplasms. However, CAR-T therapy presents certain limitations, such as lack of proliferation and persistence in vivo. A potential strategy to extend and enhance the activity of CAR-T cells is to co-express the CAR in virus- specific T cells. The aim of this doctoral thesis was to optimize a protocol to produce Epstein- Barr virus-specific T cells capable of expressing the CAR.CD19 construct from ARI-0001.

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy EBV-seropositive donors were activated using a pool of overlapping peptides derived from 15 viral antigenic proteins. Various culture conditions were tested using 24-well G-Rex® plates. The selected condition was replicated in 7 donors, achieving over 95% CD3+ T cells, with 93.5% of them being CD8+ T cells. On day 20 of culture, the median IFN-γ production was 89% for both CD3+ and CD8+ T cells, which also produced TNF-α and IL-2. EBV-specific CD8+ T cells expressed 24% of the degranulation marker in the presence of EBV antigens. Flow cytometry analysis revealed that most of the expanded cells displayed an effector memory phenotype. The production of EBV-specific T cells was successfully scaled up under good manufacturing practices, yielding results comparable to those obtained at a smaller scale. PBMCs were also stimulated with peptides from EBNA-1 and LMP2A proteins, producing a higher percentage of CD4+ T cells by day 20. The in vitro cytotoxicity assay demonstrated specific lysis between 54-69% against PHA-blasts pulsed with viral antigen peptides. TCR-β sequencing revealed increased clonality in the expanded products and allowed for the detection of EBV-specific clonotypes presented by donor HLA molecules, confirmed by tetramers assay. EBV-specific T cells transduced demonstrated the ability to co-express CAR.CD19 and eliminate target cells (NALM6) in co-culture. However, it was observed that stimulation with DynabeadsTM CD3/CD28 reversed the CD4:CD8 ratio and decreased specificity, whereas soluble anti-CD3 antibody preserved both the phenotype and specificity but decreased CAR.CD19 co-expression. Cellular expansion was limited due to the use of pre-activated and thawed EBVSTs as starting source. Different in vitro conditions were evaluated, including a proof of concept in which T cells were transfected with Yamanaka factors to induce partial reprogramming with the aim of modifying the cell differentiate state and enhancing their proliferative and antitumor capacity. Although Yamanaka factor expression was not detected, the results provided valuable insights for future process optimizations.

In conclusion, a scalable protocol under good manufacturing practices has been described for producing EBV-specific T cells, resulting in a highly pure and polyfunctional product with high specificity, capable of co-expressing the CAR.CD19 and eliminate target cells. These findings open new opportunities to explore "off-the-shelf" immunotherapy strategies, where T cells can be educated or directed, improve their persistence, proliferation, and safety in vivo.

[spa] Las células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR-T) dirigidas contra el antígeno CD19 han demostrado ser un tratamiento prometedor para neoplasias de células B. No obstante, la terapia CAR-T presenta algunas limitaciones, como la falta de proliferación y persistencia in vivo. Una posible estrategia para prolongar y potenciar la acción de células CAR-T, es co-expresar el CAR en células T específicas de virus. El objetivo de esta tesis doctoral fue optimizar un protocolo para la producción de células T específicas del virus de Epstein-Barr capaces de expresar el constructo del CAR.CD19 del ARI-0001.

Se activaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de donantes sanos EBV seropositivos mediante un pool de péptidos superpuestos derivados de 15 proteínas antigénicas del virus. Se evaluaron distintas condiciones de cultivo usando placas G-Rex® de 24 pocillos. La condición seleccionada se replicó en 7 donantes, obteniendo más del 95% de células T CD3+, con un predominio del 93.5% de células T CD8+. A día 20 de cultivo, la mediana de producción de IFN- fue del 89% para las células T CD3+ y T CD8+, además de producir TNF- e IL-2. Las células T CD8+ específicas expresaron un 24% del marcador de desgranulación en presencia de antígenos de EBV. El estudio del fenotipo por citometría de flujo reveló que la mayoría de las células expandidas exhibían un fenotipo de memoria efectora. La producción de células T específicas se escaló con éxito bajo buenas prácticas de manufactura, obteniendo resultados comparables a los obtenidos a pequeña escala. También se estimularon PBMCs con péptidos de las proteínas EBNA-1 y LMP2A, logrando a día 20 un porcentaje más elevado de células T CD4+. El ensayo de citotoxicidad in vitro mostró una lisis específica entre el 54-69% contra PHA-blastos pulsados con péptidos de los antígenos del virus. La secuenciación del TCR-β mostró una mayor clonalidad en los productos expandidos y permitió detectar clonotipos específicos de antígenos del EBV presentados por moléculas HLA del donante, confirmados por ensayo de tetrámeros. Las células T específicas de EBV transducidas demostraron ser capaces de co-expresar el CAR.CD19 y eliminar a las células diana (NALM6) en co-cultivo. No obstante, se observó que el estímulo de las DynabeadsTM CD3/CD28 invertía el ratio CD4:CD8 y disminuía la especificidad, mientras que el anticuerpo soluble anti-CD3 preservaba tanto el fenotipo como la especificidad, pero disminuía la co-expresión CAR.CD19. La expansión celular fue limitada debido al uso de EBVST pre-activadas y descongeladas como fuente de partida. Se evaluaron diferentes condiciones in vitro, incluyendo una prueba de concepto, en las que se transfectaron las células T con factores de Yamanaka para inducir una reprogramación parcial con el objetivo de modificar el estado de diferenciación celular y potenciar su capacidad proliferativa y antitumoral. Aunque no se observó la expresión de los factores de Yamanaka, los resultados obtenidos aportan información valiosa para futuras optimizaciones del proceso.

En conclusión, se ha descrito un protocolo transferible a gran escala y bajo buenas prácticas de manufactura para producir células T específicas contra el virus de EBV, logrando un producto polifuncional de alta pureza y especificidad, con potencial de co-expresar el CAR.CD19 y eliminar a las células diana. Estos hallazgos abren nuevas oportunidades para explorar estrategias de inmunoterapia “off-the-shelf”, en las que se pueda educar o dirigir a las células T, mejorando su persistencia, proliferación y seguridad in vivo.