Role of iron uptake receptors in the virulence of the emerging pathogen Enterobacter cloacae

Abstract

El ferro és un oligoelement essencial per a la supervivència i la patogenicitat bacteriana, exercint un paper crucial en el metabolisme i la virulència. Els organismes superiors presenten diferents estratègies destinades a restringir l'accés dels patògens al ferro, reduint dràsticament la seva disponibilitat, en el que es coneix com a immunitat nutricional. D'altra banda, els patògens bacterians han desenvolupat sistemes de captació d'alta afinitat per al ferro, que els permeten superar l'escassetat d'aquest element imposada per l'hoste, assegurant la seva supervivència i desenvolupament durant el procés infectiu. Aquest estudi aborda els mecanismes d'adquisició de ferro en Enterobacter cloacae, un patogen emergent responsable d'infeccions nosocomials, sovint greus. La preocupació per aquest microorganisme sobretot radica en l'existència de soques resistents a múltiples antibiòtics, així com soques panresistentes per a les quals no existeix tractament antimicrobià disponible. Això ha portat a l'Organització Mundial de la Salut (OMS) a classificar a E. cloacae com un patogen prioritari crític. No obstant això, malgrat la seva importància clínica, els mecanismes moleculars responsables de la seva virulència romanen en gran part inexplorats. En aquesta recerca s'han identificat i caracteritzat nou receptors de captació de ferro en E. cloacae ATCC1347, quatre d'ells, ECL_01520, ECL_02396, ECL_03171, ECL_04357, no descrits prèviament. Els resultats evidencien una redundància de sistemes per a la captació de ferro en E. cloacae, la qual cosa es confirma a més per l'absència d'afectació significativa en el creixement de soques mutants per a cadascun d'aquests receptors, ja que aquestes soques van mostrar un creixement in vitro equivalent al de la soca salvatge tant en presència com en absència de ferro. A més, els resultats obtinguts demostren que tots aquests receptors estan directament regulats pel metaloregulador transcripcional Fur, que dona lloc a una xarxa gènica jerarquitzada. En aquesta xarxa, s'observen diferents nivells d'expressió per als diferents receptors en funció de la concentració de ferro lliure existent. D'altra banda, els estudis realitzats usant models de virulència basats en C. elegans i d'adhesió i infecció de cèl·lules de bufeta de la línia cel·lular T24 demostren una implicació directa de set dels nou sistemes de captació de ferro en la virulència de E. cloacae. Específicament, FepA, FhuA, IutA, ECL_01520 i ECL_03171 estan vinculats amb l'adhesió del patogen a les cèl·lules de bufeta, mentre que FhuE i ECL_02396 estan relacionats amb la supervivència intracel·lular. Finalment, els estudis de prevalença realitzats a partir dels genomes disponibles en les bases de dades demostren que alguns dels receptors de ferro com FepA, FhuA i CirA, tenen una àmplia distribució no sols dins del gènere Enterobacter sinó també en la família Enterobacteriaceae. Uns altres, com ECL_03171, IutA, ECL_04357 i FhuE, presenten una distribució moderada. En canvi, ECL_01520 sembla ser específic del gènere Enterobacter, i rares vegades es troba en altres espècies de la família Enterobacteriaceae. Aquestes troballes subscriuen l'adaptació evolutiva de E. cloacae al seu nínxol ecològic i proporcionen informació crítica sobre les seves estratègies d'adquisició de ferro. Els resultats obtinguts en aquest treball subratllen la importància dels receptors de captació de ferro com a factors de virulència de E. cloacae. Almenys set d'aquests receptors estan específicament involucrats en la seva patogenicitat, i que tots exerceixen un paper important en el desenvolupament del procés infectiu. Això indica que, malgrat el que podrien suggerir els estudis in vitro, no existeix una redundància funcional en els mecanismes de captació de ferro. Per contra, alguns receptors posseeixen rols únics i primordials per a la virulència d'aquest patogen. Per tant, aquests sistemes representen dianes prometedores (algunes d'elles específiques) per al desenvolupament de teràpies que permetin el tractament d'infeccions causades per aquest patogen emergent.

El hierro es un oligoelemento esencial para la supervivencia y la patogenicidad bacteriana, desempeñando un papel crucial en el metabolismo y la virulencia. Los organismos superiores presentan distintas estrategias destinadas a restringir el acceso de los patógenos al hierro, reduciendo drásticamente su disponibilidad, en lo que se conoce como inmunidad nutricional. Por otro lado, los patógenos bacterianos han desarrollado sistemas de captación de alta afinidad para el hierro, que les permiten superar la escasez de este elemento, asegurando su supervivencia y desarrollo durante el proceso infectivo. Este estudio aborda los mecanismos de adquisición de hierro en Enterobacter cloacae, un patógeno emergente responsable de infecciones nosocomiales, a menudo graves. La preocupación por este microorganismo sobre todo radica en la existencia de cepas resistentes a múltiples antibióticos, así como cepas panresistentes para las que no existe tratamiento antimicrobiano disponible. Esto ha llevado a la Organización Mundial de la Salud (OMS) a clasificar a E. cloacae como un patógeno prioritario crítico. Sin embargo, los mecanismos moleculares responsables de su virulencia permanecen en gran parte inexplorados. En este trabajo se han identificado y caracterizado nueve receptores de captación de hierro en E. cloacae ATCC1347, cuatro de ellos, ECL_01520, ECL_02396, ECL_03171, ECL_04357, no descritos previamente. Los resultados evidencian una redundancia de sistemas para la captación de hierro en E. cloacae, lo cual se confirma además por la ausencia de afectación significativa en el crecimiento de cepas mutantes para cada uno de estos receptores, ya que dichas cepas mostraron un crecimiento in vitro equivalente a la cepa salvaje tanto en presencia como en ausencia de hierro. Además, los resultados obtenidos demuestran que todos estos receptores están directamente regulados por el metaloregulador transcripcional Fur, que da lugar a una red génica jerarquizada. En esta red, se observan diferentes niveles de expresión para los distintos receptores en función de la concentración de hierro libre existente. Por otro lado, los estudios realizados usando modelos de virulencia basados en C. elegans y de adhesión e infección de células de vejiga de la línea celular T24 demuestran una implicación directa de siete de los nueve sistemas de captación de hierro en la virulencia de E. cloacae. Específicamente, FepA, FhuA, IutA, ECL_01520 y ECL_03171 están vinculados con la adhesión del patógeno a las células de vejiga, mientras que FhuE y ECL_02396 están relacionados con la supervivencia intracelular. Finalmente, los estudios de prevalencia realizados a partir de los genomas disponibles en las bases de datos demuestran que algunos de los receptores de hierro como FepA, FhuA y CirA, tienen una amplia distribución no solo dentro del género Enterobacter sino también en la familia Enterobacteriaceae. Otros, como ECL_03171, IutA, ECL_04357 y FhuE, presentan una distribución moderada. En cambio, ECL_01520 parece ser específico del género Enterobacter, y rara vez se encuentra en otras especies de la familia Enterobacteriaceae. Estos hallazgos suscriben la adaptación evolutiva de E. cloacae a su nicho ecológico y proporcionan información sobre sus estrategias de adquisición de hierro. Los resultados obtenidos en este trabajo subrayan la importancia de los receptores de captación de hierro como factores de virulencia de E. cloacae. Al menos siete de estos receptores están específicamente involucrados en su patogenicidad, y que todos desempeñan un papel importante en el desarrollo del proceso infectivo. Esto indica que, a pesar de lo que podrían sugerir los estudios in vitro, no existe una redundancia funcional en los mecanismos de captación de hierro. Por el contrario, algunos receptores poseen roles únicos y primordiales para la virulencia de este patógeno. Por lo tanto, estos sistemas representan dianas prometedoras para el desarrollo de terapias que permitan el tratamiento de infecciones causadas por este patógeno emergente.

Iron is an essential trace element for bacterial survival and pathogenicity, playing a crucial role in metabolism and virulence. Higher organisms employ various strategies to restrict Access of pathogens to iron, drastically reducing its availability in a process known as nutritional immunity. This primary defense mechanism is fundamental in inhibiting bacterial growth. Conversely, bacterial pathogens have developed high-affinity iron uptake systems that enable them to overcome the host-imposed scarcity of this element, ensuring their survival and development during infection. The exposure of these transport mechanisms on the bacterial surface (especially outer membrane receptors) and their obligatory expression during infection make them highly specific targets for the development of innovative and effective therapies against bacterial infections. This study investigates the iron acquisition mechanisms in Enterobacter cloacae, an emerging pathogen responsible for nosocomial infections, often severe. Concern regarding this microorganism lies primarily in the existence of strains resistant to multiple antibiotics, including beta-lactams and carbapenems, as well as pan-resistant strains for which no available antimicrobial treatment exists. This has led the World Health Organization (WHO) to classify E. cloacae as a critical priority pathogen. However, despite its clinical significance, the molecular mechanisms underlying its virulence remain largely unexplored. In this research, nine iron uptake receptors were identified and characterized in E. cloacae ATCC1347, four of which —ECL_01520, ECL_02396, ECL_03171, and ECL_04357— had not been previously described. The findings reveal redundancy in iron uptake systems in E. cloacae, further supported by the lack of significant growth impairment in mutant strains for each of these receptors, as these strains showed in vitro growth equivalent to the wild-type strain in both iron-rich and iron-depleted conditions. Moreover, the results indicate that all these receptors are directly regulated by the transcriptional metalloregulator Fur, creating a hierarchical genetic network. This network demonstrates varying expression levels for different receptors depending on the available free iron concentration. On the other hand, studies using virulence models based on C. elegans and adhesion and infection of bladder cells (T24 cell line) demonstrate a direct involvement of seven of the nine iron uptake systems in the virulence of E. cloacae. Specifically, FepA, FhuA, IutA, ECL_01520, and ECL_03171 are linked to pathogen adhesion to bladder cells, while FhuE and ECL_02396 are associated with intracellular survival. Finally, prevalence studies using genomes available in databases reveal that some iron receptors, such as FepA, FhuA, and CirA, have widespread distribution not only within the Enterobacter genus but also in the Enterobacteriaceae family. Others, such as ECL_03171, IutA, ECL_04357, and FhuE, exhibit moderate distribution. In contrast, ECL_01520 appears to be specific to the Enterobacter genus and is rarely found in other Enterobacteriaceae species. These findings underscore the evolutionary adaptation of E. cloacae to its ecological niche and provide critical insights into its iron acquisition strategies. The results obtained in this study emphasize the importance of iron uptake receptors as virulence factors of E. cloacae. At least seven of these receptors are specifically involved in their pathogenicity, and all play significant roles in the infection process. This suggests that contrary to what in vitro studies might imply, there is no functional redundancy in iron uptake mechanisms. Instead, certain receptors have unique and essential roles in the virulence of this pathogen. Therefore, these systems represent promising (and in some cases, specific) targets for the development of therapies to treat infections caused by this emerging pathogen.