Unraveling injury and repair mechanisms in alcohol-associated liver disease: From neutrophils to organoid-based modeling

Abstract

[eng] Alcohol-associated liver disease (ALD) is one of the leading causes of disability and premature mortality worldwide, with few therapeutic treatments. Therefore, it is important to understand the underlying mechanisms of the disease in order to develop new therapies. Neutrophil infiltration into the liver is a hallmark of chronic liver disease, particularly alcohol-associated hepatitis (HA), the most severe form of ALD. In addition, neutrophils are known to orchestrate tissue repair, especially after acute injury. However, the characteristics and role of neutrophils in chronic liver diseases, as well as their contribution to the regression of chronic damage, remain unknown. In this thesis we hypothesize that neutrophils adapt their recruitment dynamics, phenotype and function in response to signals from the liver microenvironment, playing different roles in the progression and resolution of the disease. Therefore, we wanted to characterize neutrophils and investigate their contribution to chronic liver damage and tissue repair by using human samples and murine models. On the other hand, the study of ALD is limited by the lack of optimal preclinical models. Although organoids show great potential, liver organoids derived from patient samples are limited to the dissociation of tissues obtained in advanced stages of the disease and to a cholangiocyte phenotype, which limits their usefulness. Therefore, the second hypothesis we formulated is that liver organoids can be generated from needle biopsies taken at different stages of ALD, which would allow modeling the disease and testing drugs in a personalized way. Our objective was to generate and characterize these organoids in order to discover potential therapeutic targets and test drugs. With respect to the first objective, histological analyses revealed a population of ductular reaction-associated neutrophils (DRANs) that interact closely with biliary epithelial cells and increase as the disease progresses. We demonstrated by intravital microscopy and neutrophil labeling assays in CDD-treated mice that DRANs remain immobilized around the biliary epithelium for prolonged periods. In addition, hepatic neutrophils showed a unique phenotypic and transcriptomic profile. Neutrophil depletion using an anti-Ly6G antibody as well as inhibition of neutrophil recruitment using a CXCR1/2 inhibitor reduced DRANs, ductular reaction, liver fibrosis, and angiogenesis. Finally, neutrophils deficient in PAD4 and ELANE were not able to promote cell proliferation

biliary, highlighting the role of extracellular traps and elastase in disease progression. During the resolution of chronic liver damage, we observed a reduction and delocalization of DRANs, accompanied by hepatocyte proliferation and a regression of fibrosis and expansion of the biliary tree. Neutrophil depletion during a resolution period of 5 days affected liver regeneration, showing a lower proliferation of hepatocytes, regression of fibrosis and decreased ductular reaction. The hepatic neutrophils obtained during the resolution phase showed a distinctive transcriptomic profile, enriched in pro-resolutive mediators and immature neutrophil characteristics. In addition, we were able to observe how inhibition of mature neutrophil recruitment during the resolving phase still allowed the regression of liver damage, suggesting that immature neutrophils participate in liver regeneration. Regarding the second objective, we were able to successfully generate liver organoids from intact biopsies - called b-Orgs - from patients at different stages of ALD. The phenotypic and functional analysis of the b-Orgs showed typical characteristics of hepatocytes. In addition, single-cell transcriptomic sequencing revealed a heterogeneous cellular composition that mirrors the epithelial composition of the liver of patients with ALD. In addition, the b-Orgs preserved the characteristics of the disease, identifying the association of ELF3 with loss of hepatocyte identity and disease progression. Finally, when stimulated with AHD inducers, b-Orgs exhibited pathophysiological characteristics typical of HA, which were mitigated by prednisolone, thus demonstrating the potential of b-Orgs for personalized medicine and the identification of molecular factors in ALD. In summary, this thesis provides new experimental models for the study of ALD, and relevant knowledge about the mechanisms underlying the disease, which could have a possible application in other chronic liver diseases, as well as contribute to the development of new therapeutic strategies to slow down the progression of AHD and promote tissue regeneration.

[spa] La enfermedad hepática asociada al alcohol (EHA) es una de las principales causas de discapacidad y mortalidad prematura a nivel mundial, con escasos tratamientos terapéuticos. Por lo tanto, es importante comprender los mecanismos subyacentes de la enfermedad para desarrollar nuevas terapias. La infiltración de neutrófilos en el hígado es una característica distintiva de la enfermedad hepática crónica, particularmente de la hepatitis asociada a alcohol (HA), la forma más severa de la EHA. Además, se sabe que los neutrófilos orquestan la reparación tisular, especialmente después de una lesión aguda. Sin embargo, las características y el papel de los neutrófilos en las enfermedades hepáticas crónicas, así como su contribución a la regresión del daño crónico siguen siendo desconocidos. En esta tesis hipotetizamos que los neutrófilos adaptan su dinámica de reclutamiento, fenotipo y función en respuesta a las señales del microambiente hepático, desempeñando roles distintos en la progresión y resolución de la enfermedad. Por ello, quisimos caracterizar a los neutrófilos e investigar su contribución al daño hepático crónico y la reparación tisular mediante el uso de muestras humanas y modelos murinos. Por otro lado, el estudio de la EHA está limitado por la falta de modelos preclínicos óptimos. Aunque los organoides muestran un gran potencial, los organoides hepáticos derivados de muestras de paciente están limitados a la disociación de tejidos obtenidos en etapas avanzadas de la enfermedad y a un fenotipo de colangiocito, lo que limita su utilidad. Por ello, la segunda hipótesis que formulamos es que los organoides hepáticos pueden generarse a partir de biopsias de aguja tomadas en diferentes estadios de la EHA, lo que permitiría modelar la enfermedad y testar fármacos de forma personalizada. Nuestro objetivo fue generar y caracterizar estos organoides con el fin de descubrir potenciales dianas terapéuticas y testar fármacos. Con respecto al primer objetivo, los análisis histológicos revelaron una población de neutrófilos asociados a la reacción ductular (DRANs) que interactúan estrechamente con las células epiteliales biliares y aumentan a medida que avanza la enfermedad. Demostramos mediante microscopía intravital y ensayos de marcaje de neutrófilos en ratones tratados con DDC que los DRANs permanecen inmovilizados alrededor del epitelio biliar durante períodos prolongados. Además, los neutrófilos hepáticos mostraron un perfil fenotípico y transcriptómico único. La depleción de neutrófilos utilizando un anticuerpo anti-Ly6G así como la inhibición de su reclutamiento mediante un inhibidor de CXCR1/2 redujo los DRANs, la reacción ductular, la fibrosis hepática y la angiogénesis. Por último, los neutrófilos deficientes en PAD4 y ELANE no fueron capaces de promover la proliferación de células

biliares, lo que destaca el papel de las trampas extracelulares y la elastasa en la progresión de la enfermedad. Durante la resolución del daño hepático crónico, observamos una reducción y deslocalización de los DRANs, acompañada por la proliferación de hepatocitos y una regresión de la fibrosis y expansión del arbol biliar. La depleción de neutrófilos durante un período de resolución de 5 días afectó a la regeneración hepática, mostrándose una menor proliferación de hepatocitos, regresión de la fibrosis y disminución de la reacción ductular. Los neutrófilos hepáticos obtenidos durante la fase de resolución mostraron un perfil transcriptómico distintivo, enriquecido en mediadores pro-resolutivos y características de neutrófilo inmaduro. Además, pudimos observar cómo la inhibición del reclutamiento de neutrófilos maduros durante la fase resolutiva permitió aun así la regresión del daño hepático, lo que sugiere que los neutrófilos inmaduros participan en la regeneración hepática. Respecto al segundo objetivo, pudimos generar con éxito organoides hepáticos a partir de biopsias intactas - denominados como b-Orgs - de pacientes en diferentes estadios de la EHA. El análisis fenotípico y funcional de los b-Orgs mostró características típicas de los hepatocitos. Además, la secuenciación transcriptómica de célula única reveló una composición celular heterogénea que refleja la composición epitelial del hígado de los pacientes con EHA. Además, los b-Orgs preservaron las características de la enfermedad, identificando la asociación de ELF3 con la pérdida de identidad de los hepatocitos y la progresión de la enfermedad. Finalmente, cuando se estimularon con inductores de la EHA, los b-Orgs exhibieron características patofisiológicas típicas de la HA, las cuales fueron mitigadas por la prednisolona, demostrándose así el potencial de los b-Orgs para la medicina personalizada y la identificación de factores moleculares en la EHA. En resumen, esta tesis proporciona nuevos modelos experimentales para el estudio de la EHA, y conocimientos relevantes sobre los mecanismos subyacentes a la enfermedad, los cuales podrían tener una posible aplicación en otras enfermedades hepáticas crónicas, así como contribuir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para frenar la progresión de la EHA y promover la regeneración del tejido.