Role of conjugated sterols homeostasis in plant development and stress response

Abstract

[eng] Phytosterols are a family of triterpenoid compounds that occur in free form (FS) or conjugated as steryl esters (SE), steryl glycosides (SG) and acylated steryl glycosides (ASG). Free sterols and their glycosylated derivatives are structural components of the cell membranes that play a key role in maintaining their fluidity and permeability, while SE are stored in cytoplasmic lipid droplets, where they serve as a reservoir of sterols that can be accumulated or mobilized depending on the cellular needs. In SG, the C3 hydroxyl group of the sterol backbone is linked through a glycosydic bond to a sugar moiety, which may have a long-chain fatty acid esterified to the hydroxyl group at position C6 leading to ASG. The hydroxyl group of FS can also be esterified to a long-chain fatty acid producing SE. FS are the common precursors of SG and SE, which are synthesized by the UDP-glucose:sterol glycosyltransferases (SGT) and the acyl-CoA/phospholipid:sterol acyltransferases (ASAT/PSAT), respectively . These enzymes have been cloned and characterized in different plants, including tomato, where our group has characterized SlASAT1, SlPSAT1 and the four SGTs (SlSGT1-SlSGT4). However, the specific role of these enzymes in the conjugated sterol metabolism is still not well understood. To investigate the biological function of conjugated sterols, in this thesis we have used tomato CRISPR/Cas9 slpsat1, slasat1 and slpsat1xslasat1 knock-out mutants, and SlSGT3 overexpressing plants (SlSGT3-ox) to investigate how changes in the profile of conjugated sterols may affect tomato growth and development and its response to biotic stress. The characterization of slpsat1 and slasat1 single and double knock-out mutants revealed that SlPSAT1 has a predominant role in tomato SE biosynthesis while SlASAT1 would mainly regulate the flux of the sterol pathway. The strong reduction of SE levels in the leaves, fruits and seeds associated to PSAT1 and ASAT1 inactivation affect in different ways several important cellular and physiological processes, leading to reduced leaf number of lipid droplets, enhanced seed germination speed, early leaf senescence, reduction of the overall plant size, and increased resistance of fruits to Botrytis cinerea infection. Analysis of the overall profile of free and conjugated sterols in fruits and seeds of the slpsat31 x slasat34 mutant revealed also different qualitative and quantitative effects on the composition of free and glycosylated sterols. While in fruits impaired SE biosynthesis resulted in higher levels of FS and SG and lower levels of ASG compared to the WT, no changes were observed in seed FS levels while those of SG and ASG increased drastically. Moreover, the impact of the changes in sterol composition on the metabolome of fruit and seeds has been studied, and the results have shown a differential impact on fruit and seed metabolomes, although in both

cases disruption of the free and conjugated sterol balance in the slpsat31 x slasat34 mutant induces autophagy in both organs. SlSGT3-ox plants show a significant increase in SG levels, accompanied by a marked reduction in SE in both leaves and fruits. This resulted in a strong vegetative phenotype characterized by a clear dwarfism and thickening of the internodes, while fruits are firmer than WT fruits and show a marked delay in ripening, which is most likely due to a delay in the peak of ethylene production. These results, along with the triple response to ethylene observed in SlSGT3-ox seedlings, suggests a relationship between SG and the synthesis and/or perception-sensitivity to this hormone. To gain some insight about the molecular mechanisms underlying these physiological effects, we performed a transcriptomic analysis of SlSGT3-ox seedlings. The results showed a misregulation, among others, of genes involved in developmental processes, cell wall biogenesis, cytoskeleton and organelle organization, detoxification and responses to different stimuli, that might help to explain some of the observed phenotypes. To obtain fruits equivalent to those in SlSGT3-ox plants, but avoiding the observed alterations in plant development, plants overexpressing SlSGT3 under E8 fruit specific ethylene responsive promoter have been generated and preliminary characterized. Finally, a method for isolating lipid rafts from leaves and roots has been set up. This will allow the study of the effects of altered levels of sterols on the lipid and protein composition of these plasma membrane subdomains, which have been reported to be involved in a variety of plant cell biological processes. Too gain further insight on the intracellular localization of sterols some preliminary analysis of the spatial distribution of sterols have been carried out using MALDI-MSI analysis. Altogether, the results obtained in this work demonstrate that conjugated sterols play an important role in the growth and development of tomato plants and fruits, as well as in the plant response to biotic stress. The results of this thesis project have set the basis for further studies aimed at deciphering the molecular mechanisms underlaying the perturbations observed in these physiological processes.

[cat] Els fitosterols són una família de compostos triterpenoides que es troben en forma lliure (FS) o conjugada com a esteril èsters (SE), esteril glucòsids (SG) i acil esteril glucòsids (ASG). Els esterols lliures i els seus derivats glicosilats són components estructurals de les membranes cel·lulars que juguen un paper clau en el manteniment de la seva fluïdesa i permeabilitat, mentre que els SE es guarden en gotes lipídiques citoplasmàtiques, on actuen com a reservori que es poden acumular o mobilitzar segons les necessitats cel·lulars. En els SG, el grup hidroxil C3 de l'esquelet està unit mitjançant un enllaç glicosídic a un grup de sucre, que pot tenir un àcid gras de cadena llarga esterificat al grup hidroxil en la posició C6, formant així un ASG. El grup hidroxil dels FS també es pot esterificar amb un àcid gras de cadena llarga, produint SE. Els FS són els precursors comuns dels SG i SE, que es sintetitzen mitjançant les UDP-glucosa glicosiltransferases (SGT) i les acil-CoA/fosfolípid aciltransferases (ASAT/PSAT), respectivament. Aquests enzims s'han clonat i caracteritzat en diferents plantes, incloent el tomàquet, on el nostre grup ha caracteritzat SlASAT1, SlPSAT1 i les quatre SGT (SlSGT1-SlSGT4). No obstant això, el paper específic d'aquests enzims en el metabolisme d’esterols conjugats encara no es comprèn bé. Per investigar la funció biològica dels esterols conjugats, en aquesta tesi hem utilitzat mutants knock-out de tomàquet CRISPR/Cas9 slpsat1, slasat1 i slpsat31 x slasat34, així com plantes sobreexpresores de SlSGT3 (SlSGT3-ox) per investigar com els canvis en el perfil d'estèrils conjugats poden afectar el creixement i desenvolupament del tomàquet i la seva resposta a l'estrès biòtic. La caracterització dels mutants knock-out individuals i dobles de slpsat1 i slasat1 ha revelat que SlPSAT1 té un paper predominant en la biosíntesi de SE al tomàquet, mentre que SlASAT1 regula principalment el flux de la via d'esterols. La reducció important dels nivells de SE en les fulles, fruits i llavors associada a la inactivació de PSAT1 i ASAT1 afecta de diferents maneres diversos processos cel·lulars i fisiològics importants, conduint a una reducció del nombre de gotes lipídiques a les fulles, una velocitat de germinació de llavors augmentada, una senescència foliar prematura, una reducció de la mida global de la planta i una major resistència dels fruits a la infecció per Botrytis cinerea. L'anàlisi del perfil global d'esterols lliures i conjugats en fruits i llavors del mutant slpsat31 x slasat34 també ha revelat diferents efectes qualitatius i quantitatius en la composició d'estèrils lliures i glicosilats. Mentre que en els fruits la biosíntesi deteriorada de SE resulta en nivells més alts de FS i SG i nivells més baixos d'ASG en comparació amb el WT, no s'han observat canvis en els nivells

de FS a les llavors, mentre que els nivells de SG i ASG han augmentat dràsticament. A més, l'impacte dels canvis en la composició d'estèrils en el metabolisme dels fruits i llavors ha estat estudiat, i els resultats han mostrat un impacte diferencial en el metabolisme de fruits i llavors, tot i que en ambdós casos la alteració de l'equilibri d'estèrils lliures i conjugats en el mutant slpsat31 x slasat34 indueix autofàgia en ambdós òrgans. Les plantes SlSGT3-ox mostren un augment significatiu en els nivells de SG, acompanyat d'una reducció marcada en SE tant a les fulles com als fruits. Això resulta en un fenotip vegetatiu fortament caracteritzat per un nanisme clar i un engruiximent dels entrenusos, mentre que els fruits són més ferms que els fruits WT i mostren un retard marcat en la maduració, que probablement es deu a un retard en el pic de producció d'etilè. Aquests resultats, juntament amb la resposta triple al etilè observada en les plàntules SlSGT3-ox, suggereixen una relació entre SG i la síntesi i/o percepció-sensibilitat a aquesta hormona. Per obtenir informació sobre els mecanismes moleculars subjacents a aquests efectes fisiològics, vam realitzar una anàlisi transcriptòmica de les plàntules SlSGT3-ox. Els resultats van mostrar una desregulació, entre d'altres, de gens implicats en processos de desenvolupament, biogènesi de la paret cel·lular, organització del citoesquelet i orgànuls, desintoxicació i respostes a diferents estímuls, cosa que podria ajudar a explicar alguns dels fenotips observats. Per obtenir fruits equivalents als de les plantes SlSGT3-ox, però evitant les alteracions observades en el desenvolupament de la planta, s'han generat i caracteritzat preliminarment plantes amb sobreexpressió de SlSGT3 sota un promotor específic de fruites E8 sensible al etilè. Finalment, s'ha establert un mètode per aïllar rafts lipídics de fulles i arrels. Això permetrà l'estudi dels efectes de nivells alterats d'estèrils sobre la composició lipídica i proteica d'aquests subdominis de la membrana plasmàtica, els quals s'han informat com a implicats en diversos processos biològics cel·lulars de plantes. Per obtenir més informació sobre la localització intracel·lular dels estèrils, s'han realitzat algunes anàlisis preliminars de la distribució espacial dels estèrils utilitzant l'anàlisi MALDI-MSI. En conjunt, els resultats obtinguts en aquest treball demostren que els esterols conjugats juguen un paper important en el creixement i desenvolupament de les plantes i fruits de tomàquet, així com en la resposta de la planta a l'estrès biòtic. Els resultats d'aquest projecte de tesi han establert les bases per a futurs estudis encaminats a desxifrar els mecanismes moleculars subjacents a les alteracions observades en aquests processos fisiològics.