Identification and Preclinical Evaluation of Asenapine Maleate as a Direct Survivin Inhibitor for Lung Cancer Therapy and Sensitization to Proapoptotic Treatments

Abstract

[eng] A major challenge in cancer treatment is the ability of cancer cells to evade cell death, a hallmark of cancer that drives both disease progression and treatment resistance. Overexpression of anti-apoptotic proteins, such as survivin, is a pivotal factor in this process, since survivin promotes cell cycle progression and inhibits apoptosis. Its dual role makes survivin a compelling therapeutic target, and numerous strategies aimed at inhibiting its expression or function have shown promise in preclinical and early clinical studies. However, these approaches often fall short as standalone treatments, likely due to incomplete survivin inhibition. Previous investigations in our laboratory were focused on the development of a survivin inhibitor with a different mechanism of action than those evaluated in clinical trials. This led to the identification of asenapine maleate (AM), a known antipsychotic, as a direct inhibitor of survivin that binds to the homodimerization domain. Preliminary studies revealed that AM exhibits potent anticancer activity, positioning it as a promising candidate for further development in cancer therapy. The aim of this project is the preclinical development of the novel direct survivin inhibitor AM for the treatment of lung cancer, as well as the evaluation of AM in combination with conventional pro-apoptotic therapies to sensitize cancer cells to conventional treatments. For this purpose, the cytotoxic effects of AM were evaluated in various lung cancer cell lines, 3D lung cancer cell cultures and primary cultures derived from mice. The mechanism of action of AM predicted by computational methods was validated by investigating the impact of AM on survivin homodimers. The effects of AM on the two primary functions of survivin—regulation of cell cycle progression and inhibition of apoptosis—were further analyzed using flow cytometry and Western blotting, providing comprehensive insights into its anticancer potential.

[cat] Un dels principals reptes en el tractament del càncer és l'evitació de la mort cel·lular per part de les cèl·lules canceroses, fet que comporta la progressió de la malaltia i una possible resistència al tractament. La sobreexpressió de proteïnes inhibidores de l'apoptosi com la survivina és fonamental en aquest procés, ja que la survivina promou la progressió del cicle cel·lular i inhibeix l'apoptosi. La seva doble funció fa de la survivina una bona diana terapèutica, i nombroses estratègies dirigides a inhibir-ne l'expressió o la funció han resultat prometedores en estudis preclínics i en els primers estudis clínics. No obstant això, aquests enfocaments no han estat eficaços com a tractaments independents, probablement a causa d'una inhibició incompleta de la survivina. Investigacions prèvies en el nostre laboratori es van centrar en el desenvolupament d'un inhibidor de la survivina amb un mecanisme d'acció diferent dels fins ara avaluats en assajos clínics. Això va conduir a la identificació del maleat d'asenapina (AM), un conegut antipsicòtic, com un inhibidor directe de la survivina que actua sobre el domini d'homodimerització. Els estudis preliminars van revelar que AM presenta una potent activitat anticancerosa, fet que el situa com un candidat prometedor per al desenvolupament en la teràpia del càncer. L'objectiu d'aquest projecte és el desenvolupament preclínic del nou inhibidor directe de la survivina, AM, per al tractament del càncer de pulmó, així com l'avaluació de AM en combinació amb teràpies proapoptòtiques convencionals amb l'objectiu de sensibilitzar les cèl·lules canceroses a aquests tractaments. Es van avaluar els efectes citotòxics de AM en diverses línies cel·lulars de càncer de pulmó, cultius cel·lulars tridimensionals de càncer de pulmó i cultius primaris derivats de tumors de ratolins. El mecanisme d'acció de AM predit mitjançant mètodes computacionals es va validar avaluant l'impacte de AM sobre els homodímers de la survivina. Els efectes de AM sobre les dues funcions principals de la survivina —la regulació de la progressió del cicle cel·lular i la inhibició de l'apoptosi— es van analitzar mitjançant citometria de flux i Western blot, proporcionant una visió completa del seu potencial anticancerós. A més, vam explorar el potencial de la combinació de AM amb quimioteràpia, radioteràpia i immunoteràpia. La interacció entre AM i els agents quimioterapèutics d'ús comú es va avaluar analitzant els efectes citotòxics d'aquestes combinacions mitjançant un programari especialitzat. També es va avaluar l'impacte de la combinació més eficaç en la progressió del cicle cel·lular i l'apoptosi. Es va analitzar la inducció de danys a l'ADN després del tractament amb AM i radiació, així com els conseqüents efectes sobre l'apoptosi, la progressió del cicle cel·lular i la proliferació. La citometria de flux va permetre examinar els canvis en la progressió del cicle cel·lular i l'apoptosi, confirmada aquesta última mitjançant la tècnica de Western blot. A més, es va avaluar el potencial clonogènic de les cèl·lules després del tractament combinat. Per determinar si AM podria sensibilitzar les cèl·lules tumorals a la immunoteràpia i millorar així l'eficàcia dels tractaments basats en la immunitat, vam investigar si AM podria desencadenar i potenciar una possible resposta immune adaptativa in vivo contra cèl·lules apoptòtiques o danyades. Per a això, es va analitzar l'alliberament de patrons moleculars associats a danys (DAMPs). L'avaluació preclínica in vivo de AM i la seva combinació amb cisplatí es va dur a terme en diversos models de ratolí. La seguretat de AM es va avaluar en un model de ratolí C57BL/6J. Per analitzar l'eficàcia de AM i la seva combinació amb cisplatí, es va desenvolupar un model de tumor subcutani en ratolins C57BL/6J. A més, la combinació es va estudiar en ratolins NSG immunodeficients, als quals es van inocular cèl·lules humanes de càncer de pulmó per induir un tumor subcutani. Finalment, aquesta combinació també es va provar en ratolins transgènics KRASG12D, que desenvolupen càncer de pulmó després de la inhalació de virus que expressen la Cre recombinasa. AM demostra activitat citotòxica en diverses línies cel·lulars humanes de càncer de pulmó, com l'adenocarcinoma de pulmó (A549), el carcinoma de cèl·lules escatoses (SW900) i el carcinoma pulmonar de cèl·lules petites (DMS53), així com en la línia cel·lular de carcinoma pulmonar murí de Lewis (LLC1) i en cultius primaris de ratolí. La seva eficàcia s'estén als esferoides d'adenocarcinoma de pulmó, fet que posa de manifest el seu potencial en models cel·lulars més complexos. AM interromp la homodimerització de la survivina, desestabilitzant la proteïna i inhibint-la selectivament en cèl·lules d'adenocarcinoma de pulmó A549 i de glioblastoma U87 MG, sense afectar l'expressió de XIAP, un altre membre de la família de proteïnes inhibidores de l'apoptosi (IAPs). Els efectes anticancerosos de AM es deuen a la detenció del cicle cel·lular en la fase G0/G1 i a la inducció de l'apoptosi. Quan es combina amb cisplatí, carboplatí o gemcitabina, AM actua de manera sinèrgica, sensibilitzant les cèl·lules A549 a aquests agents quimioterapèutics. En particular, AM potencia l'apoptosi induïda per cisplatí en cèl·lules de càncer de pulmó. A més, el pretractament amb AM abans de la irradiació indueix canvis morfològics similars als que es donen en el procés de senescència. Així mateix, AM potencia la reducció de la capacitat clonogènica induïda per la radiació en cèl·lules canceroses. AM augmenta l’alliberament de DAMPs, fet que pot suggerir una potencial capacitat de AM per estimular la resposta immunitària contra el tumor in vivo. Els estudis preclínics en ratolins han demostrat que AM té un perfil de seguretat favorable en dosis inferiors a 20 mg/kg. A més, AM combinat amb cisplatí redueix significativament el creixement tumoral en models de ratolí. En conclusió, AM demostra un important potencial anticancerós dirigint-se selectivament contra la survivina, induint la detenció del cicle cel·lular i l'apoptosi, i augmentant l'eficàcia de la quimioteràpia i la radioteràpia. La seva capacitat per induir l'alliberament de DAMPs demostra el potencial de AM per promoure respostes immunitàries, destacant encara més la seva promesa terapèutica. Els estudis preclínics confirmen la seguretat i eficàcia de AM en la reducció del creixement tumoral quan es combina amb cisplatí, fet que el situa com un candidat prometedor per a les teràpies combinades en el tractament del càncer de pulmó.

[cat] Un dels principals reptes en el tractament del càncer és l'evitació de la mort cel·lular per part de les cèl·lules canceroses, fet que comporta la progressió de la malaltia i una possible resistència al tractament. La sobreexpressió de proteïnes inhibidores de l'apoptosi com la survivina és fonamental en aquest procés, ja que la survivina promou la progressió del cicle cel·lular i inhibeix l'apoptosi. La seva doble funció fa de la survivina una bona diana terapèutica, i nombroses estratègies dirigides a inhibir-ne l'expressió o la funció han resultat prometedores en estudis preclínics i en els primers estudis clínics. No obstant això, aquests enfocaments no han estat eficaços com a tractaments independents, probablement a causa d'una inhibició incompleta de la survivina. Investigacions prèvies en el nostre laboratori es van centrar en el desenvolupament d'un inhibidor de la survivina amb un mecanisme d'acció diferent dels fins ara avaluats en assajos clínics. Això va conduir a la identificació del maleat d'asenapina (AM), un conegut antipsicòtic, com un inhibidor directe de la survivina que actua sobre el domini d'homodimerització. Els estudis preliminars van revelar que AM presenta una potent activitat anticancerosa, fet que el situa com un candidat prometedor per al desenvolupament en la teràpia del càncer. L'objectiu d'aquest projecte és el desenvolupament preclínic del nou inhibidor directe de la survivina, AM, per al tractament del càncer de pulmó, així com l'avaluació de AM en combinació amb teràpies proapoptòtiques convencionals amb l'objectiu de sensibilitzar les cèl·lules canceroses a aquests tractaments. Es van avaluar els efectes citotòxics de AM en diverses línies cel·lulars de càncer de pulmó, cultius cel·lulars tridimensionals de càncer de pulmó i cultius primaris derivats de tumors de ratolins. El mecanisme d'acció de AM predit mitjançant mètodes computacionals es va validar avaluant l'impacte de AM sobre els homodímers de la survivina. Els efectes de AM sobre les dues funcions principals de la survivina —la regulació de la progressió del cicle cel·lular i la inhibició de l'apoptosi— es van analitzar mitjançant citometria de flux i Western blot, proporcionant una visió completa del seu potencial anticancerós. A més, vam explorar el potencial de la combinació de AM amb quimioteràpia, radioteràpia i immunoteràpia. La interacció entre AM i els agents quimioterapèutics d'ús comú es va avaluar analitzant els efectes citotòxics d'aquestes combinacions mitjançant un programari especialitzat. També es va avaluar l'impacte de la combinació més eficaç en la progressió del cicle cel·lular i l'apoptosi. Es va analitzar la inducció de danys a l'ADN després del tractament amb AM i radiació, així com els conseqüents efectes sobre l'apoptosi, la progressió del cicle cel·lular i la proliferació. La citometria de flux va permetre examinar els canvis en la progressió del cicle cel·lular i l'apoptosi, confirmada aquesta última mitjançant la tècnica de Western blot. A més, es va avaluar el potencial clonogènic de les cèl·lules després del tractament combinat. Per determinar si AM podria sensibilitzar les cèl·lules tumorals a la immunoteràpia i millorar així l'eficàcia dels tractaments basats en la immunitat, vam investigar si AM podria desencadenar i potenciar una possible resposta immune adaptativa in vivo contra cèl·lules apoptòtiques o danyades. Per a això, es va analitzar l'alliberament de patrons moleculars associats a danys (DAMPs). L'avaluació preclínica in vivo de AM i la seva combinació amb cisplatí es va dur a terme en diversos models de ratolí. La seguretat de AM es va avaluar en un model de ratolí C57BL/6J. Per analitzar l'eficàcia de AM i la seva combinació amb cisplatí, es va desenvolupar un model de tumor subcutani en ratolins C57BL/6J. A més, la combinació es va estudiar en ratolins NSG immunodeficients, als quals es van inocular cèl·lules humanes de càncer de pulmó per induir un tumor subcutani. Finalment, aquesta combinació també es va provar en ratolins transgènics KRASG12D, que desenvolupen càncer de pulmó després de la inhalació de virus que expressen la Cre recombinasa. AM demostra activitat citotòxica en diverses línies cel·lulars humanes de càncer de pulmó, com l'adenocarcinoma de pulmó (A549), el carcinoma de cèl·lules escatoses (SW900) i el carcinoma pulmonar de cèl·lules petites (DMS53), així com en la línia cel·lular de carcinoma pulmonar murí de Lewis (LLC1) i en cultius primaris de ratolí. La seva eficàcia s'estén als esferoides d'adenocarcinoma de pulmó, fet que posa de manifest el seu potencial en models cel·lulars més complexos. AM interromp la homodimerització de la survivina, desestabilitzant la proteïna i inhibint-la selectivament en cèl·lules d'adenocarcinoma de pulmó A549 i de glioblastoma U87 MG, sense afectar l'expressió de XIAP, un altre membre de la família de proteïnes inhibidores de l'apoptosi (IAPs). Els efectes anticancerosos de AM es deuen a la detenció del cicle cel·lular en la fase G0/G1 i a la inducció de l'apoptosi. Quan es combina amb cisplatí, carboplatí o gemcitabina, AM actua de manera sinèrgica, sensibilitzant les cèl·lules A549 a aquests agents quimioterapèutics. En particular, AM potencia l'apoptosi induïda per cisplatí en cèl·lules de càncer de pulmó. A més, el pretractament amb AM abans de la irradiació indueix canvis morfològics similars als que es donen en el procés de senescència. Així mateix, AM potencia la reducció de la capacitat clonogènica induïda per la radiació en cèl·lules canceroses. AM augmenta l’alliberament de DAMPs, fet que pot suggerir una potencial capacitat de AM per estimular la resposta immunitària contra el tumor in vivo. Els estudis preclínics en ratolins han demostrat que AM té un perfil de seguretat favorable en dosis inferiors a 20 mg/kg. A més, AM combinat amb cisplatí redueix significativament el creixement tumoral en models de ratolí. En conclusió, AM demostra un important potencial anticancerós dirigint-se selectivament contra la survivina, induint la detenció del cicle cel·lular i l'apoptosi, i augmentant l'eficàcia de la quimioteràpia i la radioteràpia. La seva capacitat per induir l'alliberament de DAMPs demostra el potencial de AM per promoure respostes immunitàries, destacant encara més la seva promesa terapèutica. Els estudis preclínics confirmen la seguretat i eficàcia de AM en la reducció del creixement tumoral quan es combina amb cisplatí, fet que el situa com un candidat prometedor per a les teràpies combinades en el tractament del càncer de pulmó.