Metabolic engineering of Komagataella phaffii for renewable methanol bioconversion into 3-hydroxypropionic acid

Abstract

El metanol està emergint com una matèria primera d’interès creixent per a la producció de compostos químics d’alt valor a partir de microorganismes, gràcies al seu origen potencialment renovable (per exemple, a partir de CO2) i els avantatges econòmics i ambientals que ofereix. En aquest context, el llevat metilòtrof Komagataella phaffii (també conegut com Pichia pastoris) destaca com una factoria cel·lular prometedora per a la indústria química basada en metanol.

K. phaffii no només és capaç d’assimilar metanol, sinó que també presenta altres avantatges metabòlics i industrials, com la compartimentació de rutes sintètiques gràcies a la presència d'orgànuls (peroxisomes, mitocòndries) i la seva tolerància natural a condicions àcides, fet especialment rellevant per a la producció d’àcids carboxílics. En aquesta tesi, K. phaffii ha estat modificat genèticament per produir àcid 3-hidroxipropiònic (3-HP) a partir de fonts de carboni renovables com el metanol.

El 3-HP és un àcid orgànic de tres carbonis considerat un producte plataforma, atès que és precursor de l'àcid acrílic i altres compostos industrials. Tot i que ja s’ha aconseguit produir-lo biològicament en diversos microorganismes, les mètriques de producció continuen sent un repte per a la seva aplicació industrial generalitzada. L’enginyeria metabòlica, per tant, juga un paper clau per millorar aquests paràmetres.

Aquesta tesi comença amb la compartimentació de la ruta metabòlica del malonil-CoA al peroxisoma, mitjançant la localització del gen mcr de Chloroflexus aurantiacus en aquest orgànul i l'aplicació d'altres estratègies d'enginyeria per augmentar la disponibilitat de precursors. Tot i això, la producció de 3-HP fou inferior a la de les soques amb producció citosòlica. La producció peroxisomal de 3-HP es va reconceptualitzar com un sistema biosensor per estudiar la disponibilitat de NADPH en aquest orgànul. A través d'aquest sistema es va poder identificar una estratègia prometedora per augmentar el NADPH peroxisomal: la coproducció del sistema llançadora Idp2/Idp3 i la NADH quinasa citosòlica cPos5 de Saccharomyces cerevisiae.

Tot i les prometedores aplicacions de la ruta peroxisomal, la producció citosòlica es va establir com la millor opció per obtenir altes productivitats. A més, mitjançant simulacions amb un model metabòlic a escala genòmica de K. phaffii, la ruta de la β-alanina fou identificada com una via més eficient que la del malonil-CoA per produir 3-HP a partir de metanol. Així, es va implementar per primera vegada aquesta ruta en K. phaffii mitjançant l’expressió dels gens heteròlegs panD, yhxA i ydfG. L’optimització d'aquesta soca va permetre obtenir fins a 21.4 g/L de 3-HP amb un rendiment de 0.15 g/g i una productivitat volumètrica de 0.48 g/L·h.

Aquesta soca fou millorada a través de la introducció d'una variant de formiat deshidrogenasa NADP⁺-dependent per augmentar la disponibilitat de NADPH, la qual va resultar en millores en el consum de metanol i en la productivitat específica de 3-HP. A més, un segon cicle d’enginyeria metabòlica enfocat a incrementar precursors i l'exportació de 3-HP va donar lloc a la soca amb millors rendiments. El seu cultiu en discontinu alimentat (fed-batch) augmentà un 42% la concentració de 3-HP i un 22% la productivitat volumètrica en comparació a la soca de referència. A més, els cultius a pH 3.5 van demostrar el paper dels transportadors d’àcids monocarboxílics en la tolerància al 3-HP en condicions àcides.

En conjunt, aquesta tesi demostra el potencial de K. phaffii per a la producció sostenible de 3-HP a partir de metanol, assolint la productivitat volumètrica més alta reportada fins ara en aquest context.

El metanol está emergiendo como una materia prima de interés creciente para la producción de compuestos químicos de alto valor a partir de microorganismos, gracias a su origen potencialmente renovable (por ejemplo, a partir de CO₂) y a las ventajas económicas y medioambientales que ofrece. En este contexto, la levadura metilotrófica Komagataella phaffii (también conocida como Pichia pastoris) destaca como una fábrica celular prometedora para la industria química basada en metanol.

K. phaffii no solo es capaz de asimilar metanol, sino que también presenta otras ventajas metabólicas e industriales, como la compartimentación de rutas sintéticas gracias a la presencia de orgánulos (peroxisomas, mitocondrias) y su tolerancia natural a condiciones ácidas, lo cual es especialmente relevante para la producción de ácidos carboxílicos. En esta tesis, K. phaffii ha sido modificado genéticamente para producir ácido 3-hidroxipropiónico (3-HP) a partir de fuentes de carbono renovables como el metanol.

El 3-HP es un ácido orgánico de tres carbonos considerado un producto plataforma, ya que es precursor del ácido acrílico y otros compuestos industriales. Aunque ya se ha logrado producirlo biológicamente en diversos microorganismos, las métricas de producción siguen siendo un desafío para su aplicación industrial generalizada. La ingeniería metabólica, por tanto, desempeña un papel clave para mejorar estos parámetros.

La tesis comienza con la compartimentación de la ruta metabólica del malonil-CoA en el peroxisoma, mediante la localización del gen mcr de Chloroflexus aurantiacus en este orgánulo y la aplicación de otras estrategias de ingeniería para aumentar la disponibilidad de precursores. No obstante, la producción de 3-HP fue inferior a la de las cepas con producción citosólica. La producción peroxisomal de 3-HP se reconceptualizó como un sistema biosensor para estudiar la disponibilidad de NADPH en este orgánulo. A través de este sistema se pudo identificar una estrategia prometedora para aumentar el NADPH peroxisomal: la coproducción del sistema lanzadera Idp2/Idp3 y la NADH quinasa citosólica cPos5 de Saccharomyces cerevisiae.

A pesar de las prometedoras aplicaciones de la ruta peroxisomal, la producción citosólica se estableció como la mejor opción para obtener altas productividades. Además, mediante simulaciones con un modelo metabólico a escala genómica de K. phaffii, la ruta de la β-alanina fue identificada como una vía más eficiente que la del malonil-CoA para producir 3-HP a partir de metanol. Así, se implementó por primera vez esta ruta en K. phaffii mediante la expresión de los genes heterólogos panD, yhxA y ydfG. La optimización de esta cepa permitió obtener hasta 21.4 g/L de 3-HP con un rendimiento de 0.15 g/g y una productividad volumétrica de 0.48 g/L·h.

Esta cepa fue mejorada mediante la introducción de una variante de formiato deshidrogenasa NADP⁺-dependiente para aumentar la disponibilidad de NADPH, lo que resultó en mejoras en el consumo de metanol y en la productividad específica de 3-HP. Además, un segundo ciclo de ingeniería metabólica enfocado en incrementar precursores y la exportación de 3-HP dio lugar a la cepa con mejores rendimientos. Su cultivo en discontinuo alimentado (fed-batch) aumentó en un 42% la concentración de 3-HP y en un 22% su productividad volumétrica en comparación a la cepa de referencia. Además, los cultivos a pH 3.5 demostraron el papel de los transportadores de ácidos monocarboxílicos en la tolerancia al 3-HP en condiciones ácidas.

En conjunto, esta tesis demuestra el potencial de K. phaffii para la producción sostenible de 3-HP a partir de metanol, alcanzando la productividad volumétrica más alta reportada hasta la fecha en este contexto.

Methanol is emerging as a feedstock of growing interest for the production of high-value chemicals using microorganisms, due to its potentially renewable origin (e.g., from CO₂) and the economic and environmental advantages it offers. In this context, the methylotrophic yeast Komagataella phaffii (also known as Pichia pastoris) stands out as a promising microbial cell factory for methanol-based chemical production.

K. phaffii is not only capable of assimilating methanol, but also exhibits other metabolic and industrial advantages, such as the compartmentalization of synthetic pathways thanks to the presence of organelles (peroxisomes, mitochondria) and its natural tolerance to acidic conditions, which is particularly relevant for the production of carboxylic acids. In this thesis, K. phaffii was genetically engineered to produce 3-hydroxypropionic acid (3-HP) from renewable carbon sources such as methanol.

3-HP is a three-carbon organic acid considered a platform chemical, as it is a precursor of acrylic acid and other industrial compounds. Although biological production of 3-HP has already been achieved in various microorganisms, production metrics remain a bottleneck for its widespread industrial application. Metabolic engineering, therefore, plays a key role in improving these parameters.

The thesis begins with the compartmentalization of the malonyl-CoA pathway in the peroxisome, by targeting the mcr gene from Chloroflexus aurantiacus to this organelle and applying additional engineering strategies to enhance precursor availability. However, 3-HP production was lower than in strains with cytosolic production. Peroxisomal 3-HP production was reconceptualized as a biosensor system to study NADPH availability in the organelle. Using this system, a promising strategy was identified to increase peroxisomal NADPH: co-expression of the Idp2/Idp3 shuttle system and the cytosolic NADH kinase cPos5 from Saccharomyces cerevisiae.

Despite the promising applications of the peroxisomal pathway, cytosolic production proved to be the best option for achieving high productivities. Furthermore, by using a genome-scale metabolic model of K. phaffii, the β-alanine pathway was identified as an efficient alternative to the malonyl-CoA route for 3-HP production from methanol. This pathway was implemented in K. phaffii for the first time by expressing the heterologous genes panD, yhxA, and ydfG. Optimization of this strain enabled production of up to 21.4 g/L of 3-HP with a yield of 0.15 g/g and a volumetric productivity of 0.48 g/L·h.

This strain was further improved by introducing a NADP⁺-dependent formate dehydrogenase variant to increase NADPH availability, resulting in improved methanol consumption and specific 3-HP productivity. Additionally, a second cycle of metabolic engineering focusing on enhancing precursor supply and 3-HP export led to the construction of our top-performing strain, which increased 3-HP titer by 42% and volumetric productivity by 22% under fed-batch conditions, compared to the reference strain. Moreover, cultures at pH 3.5 demonstrated the role of monocarboxylic acid transporters in 3-HP tolerance under acidic conditions.

Altogether, this thesis demonstrates the potential of K. phaffii for sustainable 3-HP production from methanol, achieving the highest volumetric productivity reported to date in this context.