Isolation, Culture and Characterization of Klinefelter Spermatogonial Stem Cells

Abstract

[eng] INTRODUCTION: Klinefelter syndrome (KS) is a chromosomal abnormality that affects approximately 1 in 500-1000 male births. Their most frequent karyotype is 47XXY and up to 10% of them present significant mosaicism in the study of peripheral blood. In most cases, KS patients remain asymptomatic until adulthood when male infertility leads to diagnosis. A progressive loss of germ cells has been described that accelerates during puberty until extensive testicular fibrosis is established, leaving more than 90% of patients azoospermic.

According to the current literature, approximately 8% of KS patients have functional spermatozoa in the ejaculate, resulting in healthy euploid offspring through natural conception or advanced fertility therapies. In azoospermic KS patients, isolated foci of testicular tissue with preserved spermatogenesis have been described, so testicular biopsy has been established as the treatment of choice. However, the success rate for sperm extraction in KS patients remains below 50% and the chances of achieving a healthy newborn are around 15%.

Even in KS patients without viable spermatozoa in testicular biopsy, the pathological analysis of the samples has described the presence of undifferentiated spermatogonia. Spermatogonial stem cells (SSCs) are a small population of especially undifferentiated spermatogonia present in the basement membrane of the seminiferous tubules. SSCs have both the capacity for self-renewal as well as for differentiation towards spermatogenesis, maintaining the balance of the seminiferous tubules. In turn, the most characteristic quality attributed to SSCs is the ability to migrate to the basement membrane of seminiferous tubules of azoospermic subjects and reestablish spermatogenesis.

It has been postulated that SSCs could be used in new experimental fertility therapies for KS patients without sperm available in testicular biopsies. This new generation of experimental advanced fertility techniques includes: SSC transplantation, in vitro spermatogenesis, ex vivo maturation of testicular tissue, and testicular tissue grafting. All of them have shown promising results in animal models as well as in preclinical studies and are at different levels of development towards clinical applicability.

An essential aspect of any fertility treatment is the value of using the patient's autologous material in order to pass on their genetic material to their offspring. Most of the previously mentioned experimental SSC-based therapies require a significant number of cells to be viable. Some researchers have managed to propagate in vitro euploid testicular cells from rodents and humans while maintaining the characteristics of a putative SSC population. However, it is unknown whether these techniques would be reproducible in aneuploid subjects such as KS.

HYPOTHESIS: Our hypothesis is that current methods of in vitro isolation and propagation of testicular cells could be adapted to the specific needs of testicular tissue of mice and humans with KS. Testicular organoids formed from testicular SK cells could provide insight into the pathophysiology of KS. Testicular organoids could also be a step towards new fertility therapies for KS patients.

OBJECTIVES: 1. To isolate, propagate, and characterize testicular cells from XXY mice, including a population of putative SSCs. 2. Isolate, propagate, and characterize testicular cells from XXY humans, including a population of putative SSCs. 3. Forming 3D testicular organoids from XXY human testicular cells and assessing their potential

[cat] INTRODUCCIÓ: La síndrome de Klinefelter (SK) és una alteració cromosòmica que afecta aproximadament 1 de cada 500-1000 infants nascuts. El seu cariotip més freqüent és 47XXY i fins a un 10% presenten mosaïcisme significatiu a l’estudi de sang perifèrica. A la majoria de casos, els pacients SK romanen asimptomàtics fins l'edat adulta quan la infertilitat masculina orienta el diagnòstic. S'ha descrit una pèrdua progressiva de cèl·lules germinals que s'accelera durant la pubertat fins a establir una fibrosi testicular extensa que deixa més del 90% dels pacients azoospèrmics.

Segons la literatura actual, aproximadament el 8% dels pacients SK presenten espermatozous funcionals a l'ejaculat, donant lloc a descendència euploide i sana mitjançant concepció natural o teràpies de fertilitat avançada. Als pacients SK azoospèrmics, s'han descrit focus aïllats de teixit testicular amb espermatogènesi preservada i en conseqüència la biòpsia testicular s'ha establert com a tractament d'elecció. Tot i així, la taxa d'èxit per a l'extracció d'espermatozous en pacients SK roman per sota del 50% i les probabilitats d'aconseguir un nadó sa es troba al voltant del 15%.

Fins i tot en pacients SK sense espermatozous viables a la biòpsia testicular, l'anàlisi anatomopatològica de les mostres ha descrit la presència d'espermatogonies indiferenciades. Les cèl·lules mare espermatogonials (SSC) són una petita població d'espermatogonies especialment indiferenciades presents a la membrana basal dels túbuls seminífers. Les SSC tenen tant la capacitat per a la pròpia autorenovació com per a la diferenciació cap a l'espermatogènesi, mantenint l'equilibri dels túbuls seminífers. Alhora, la qualitat més característica atribuïda a les SSC és la capacitat per migrar fins a la membrana basal de túbuls seminífers de subjectes azoospèrmics i restablir l'espermatogènesi.

S'ha postulat que les SSC podrien ser utilitzades en noves teràpies de fertilitat experimentals per a pacients SK sense espermatozous disponibles a biòpsies testiculars. Dins aquesta nova generació de tècniques de fertilitat avançada experimentals s'inclouen: trasplantament de SSC, espermatogènesi in vitro, maduració ex vivo de teixit testicular i empelt de teixit testicular. Totes han mostrat resultats prometedors en models animals, així com en estudis preclínics i es troben a diferents nivells de desenvolupament cap a l'aplicabilitat clínica.

Un aspecte essencial a qualsevol tractament de fertilitat és el valor de l'ús de material autòleg del pacient per tal de transmetre el material genètic a la seva descendència. La majoria de les teràpies experimentals basades en SSC prèviament esmentades requereixen un nombre significatiu de cèl·lules per a ser viables. Alguns investigadors han aconseguit propagar in vitro cèl·lules testiculars euploides de rosegadors i humans mantenint les característiques pròpies d'una putativa població de SSC. No obstant això, es desconeix si aquestes tècniques serien reproduïbles en subjectes aneuploides com SK.

HIPÒTESI: La nostra hipòtesi és que els mètodes actuals d'aïllament i propagació in vitro de cèl·lules testiculars podrien ser adaptat a les necessitats específiques del teixit testicular de ratolins i humans amb SK.

Organoides testiculars formats a partir de cèl·lules testiculars SK podrien aportar coneixement sobre la fisiopatologia del SK. Els organoides testiculars podrien també suposar un avenç cap a noves teràpies de fertilitat per a pacients SK.

OBJECTIUS:

1. Aïllar, propagar i caracteritzar cèl·lules testiculars procedents de ratolins XXY, inclosa una població de putatives SSC.

2. Aïllar, propagar i caracteritzar cèl·lules testiculars procedents dels humans XXY, inclosa una població de putatives SSC.

3. Formar organoides testiculars en 3D a partir de cèl·lules testiculars humanes XXY i avaluar-ne el potencial com a model de SK in vitro; i com a eina per a l'espermatogènesi in vitro.

[spa] INTRODUCCIÓN: El síndrome de Klinefelter (SK) es una alteración cromosómica que afecta aproximadamente a 1 de cada 500-1000 nacidos varones. Su cariotipo más frecuente es 47XXY y hasta un 10% de ellos presentan mosaicismo significativo en el estudio de sangre periférica. En la mayoría de casos, los pacientes SK permanecen asintomáticos hasta la edad adulta cuando la infertilidad masculina orienta al diagnóstico. Se ha descrito una pérdida progresiva de células germinales que se acelera durante la pubertad hasta establecer una fibrosis testicular extensa dejando a más del 90% de los pacientes azoospérmicos.

Según la literatura actual, aproximadamente 8% de los pacientes SK presentan espermatozoides funcionales en el eyaculado, dando lugar a descendencia euploide y sana mediante concepción natural o terapias de fertilidad avanzada. En los pacientes SK azoospérmicos, se han descrito focos aislados de tejido testicular con espermatogénesis preservada por lo que la biopsia testicular se ha establecido como tratamiento de elección. No obstante, la tasa de éxito para la extracción de espermatozoides en pacientes SK permanece por debajo del 50% y las probabilidades de conseguir un recién nacido sano se encuentra alrededor del 15%.

Incluso en pacientes SK sin espermatozoides viables en biopsia testicular, el análisis anatomopatológico de las muestras ha descrito la presencia de espermatogonias indiferenciadas. Las células madre espermatogoniales (SSC) son una pequeña población de espermatogonias especialmente indiferenciadas presentes en la membrana basal de los túbulos seminíferos. Las SSC tienen tanto la capacidad para la propia autorenovación así como para la diferenciación hacia la espermatogénesis, manteniendo el equilibrio de los túbulos seminíferos. A su vez, la cualidad más característica atribuida a las SSC es la capacidad para migrar hasta la membrana basal de túbulos seminíferos de sujetos azoospérmicos y reestablecer la espermatogénesis.

Se ha postulado que las SSC podrían ser utilizadas en nuevas terapias de fertilidad experimentales para pacientes SK sin espermatozoides disponibles en biopsias testiculares. Dentro de esta nueva generación de técnicas de fertilidad avanzada experimentales se incluyen: trasplante de SSC, espermatogénesis in vitro, maduración ex vivo de tejido testicular e injerto de tejido testicular. Todas ellas han mostrado resultados prometedores en modelos animales, así como en estudios preclínicos y se encuentran a diferentes niveles de desarrollo hacia la aplicabilidad clínica.

Un aspecto esencial de cualquier tratamiento de fertilidad es el valor del uso de material autólogo del paciente a fin de transmitir su material genético a su descendencia. La mayoría de las terapias experimentales basadas en SSC previamente mencionadas requieren un número significativo de células para ser viables. Algunos investigadores han logrado propagar in vitro células testiculares euploides de roedores y humanos manteniendo las características propias de una putativa población de SSC. No obstante, se desconoce si estas técnicas serían reproducibles en sujetos aneuploides como SK.

HIPÓTESIS: Nuestra hipótesis es que los actuales métodos de aislamiento y propagación in vitro de células testiculares podría ser adaptado a las necesidades específicas del tejido testicular de ratones y humanos con SK. Organoides testiculares formados a partir de células testiculares SK podrían aportar conocimiento sobre la fisiopatología del SK. Los organoides testiculares podrían también suponer un avance hacia nuevas terapias de fertilidad para pacientes SK.

OBJETIVOS: 1. Aislar, propagar y caracterizar células testiculares procedentes de ratones XXY, incluida una población de putativas SSC. 2. Aislar, propagar y caracterizar células testiculares procedentes de humanos XXY, incluida una población de putativas SSC. 3. Formar organoides testiculares en 3D a partir de células testiculares humanas XXY y evaluar su potencial como modelo de SK in vivo y como herramienta para la espermatogénesis in vitro.