BINDSCAN: a computational protocol for the engineering of glycoside hydrolases

Abstract

L'enginyeria enzimàtica ha revolucionat l'expansió de les funcions enzimàtiques naturals, permetent el desenvolupament de nous biocatalitzadors amb propietats ajustables per a diverses aplicacions. Aquesta tesi es centra en avançar les metodologies computacionals per optimitzar el rendiment enzimàtic, especialment per a l'enginyeria de glicosil hidrolases (GH). Les GH catalitzen la ruptura hidrolítica de l'enllaç glicosídic en glicans i glicoconjugats. En els darrers anys, s'han fet esforços per reconduir la funció enzimàtica de les GH cap a l'activitat de transglicosidació per catalitzar la síntesi d'enllaços glicosídics per a la producció de carbohidrats d’alt valor afegit.

Aquesta tesi té com a objectiu ampliar les capacitats de predicció de BINDSCAN, un protocol computacional per a l'enginyeria de proteïnes desenvolupat originalment al Laboratori de Bioquímica de l'IQS School of Engineering. El protocol es basa en l'anàlisi mutacional massiva de la seqüència de proteïna per a la identificació de posicions sensibles al reconeixement de lligands. En aquesta tesi hem: i) implementat noves mètriques basades en mesures d'afinitat d'enllaç i càlculs de potencial electrostàtic, ii) optimitzat el rendiment computacional, iii) implementat una interfície gràfica per a l'anàlisi de resultats i iv) aplicat la nova versió del protocol a diferents GH d'interès.

Hem demostrat que les GH han evolucionat per generar un gradient de potencial electrostàtic al seu centre actiu complementari a la separació de càrregues desenvolupada a l'enllaç glicosídic hidrolitzable durant la catàlisi. Això ens ha permès desenvolupar una nova mètrica electrostàtica capaç d'identificar residus crucials per estabilitzar l'estat de transició de la reacció. La mètrica s'ha utilitzat pel cribratge de diferents GH: i) Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanasa (BlβGluc), ii) Thermobacillus xylanilyticus α-L-arabinofuranosidasa (TxAbf), iii) Spodoptera frugiperda β-glicosidasa (SfβGly) i Bifidobacterium bifidum lacto-N-biosidasa (BbLnbB). Els resultats han demostrat que aquesta mètrica prediu eficaçment les posicions que afecten a l'activitat hidrolítica com ara M58A a BlβGluc, R69H a TxAbf i W394F a BbLnbB. A més, hem validat el rendiment de classificació de les diferents mètriques del protocol BINDSCAN contra dades experimentals massives de SfβGly. També proposem una estratègia computacional basada en el protocol BINDSCAN per guiar el disseny de transglicosidases eficients millorant la unió de la molècula acceptora i dificultant l'activitat hidrolítica natural. Les campanyes de cribratge sobre TxAbf i BbLnbB han demostrat la capacitat del protocol per identificar variants de GH amb alts rendiments de transglicodilació: TxAbf R69H (7,3%) i BbLnbB W394F (32%), H263A (21%).

Aquesta tesi contribueix a escurçar la distància entre el disseny teòric i la validació experimental per ampliar les capacitats de l'enginyeria enzimàtica per a aplicacions industrials i biotecnològiques.

La ingeniería enzimática ha revolucionado la expansión de las funciones enzimáticas naturales, permitiendo el desarrollo de nuevos biocatalizadores con propiedades ajustables para diversas aplicaciones. Esta tesis se centra en el avance de las metodologías computacionales para optimizar el rendimiento enzimático, especialmente para la ingeniería de las glicosil hidrolasas (GH). Las GH catalizan la ruptura hidrolítica del enlace glicosídico en glicanos y glicoconjugados. En los últimos años, se ha trabajado en la reingeniería de la función enzimática de las GH hacia la actividad de transglicosidación para catalizar la síntesis de enlaces glicosídicos y así producir carbohidratos de alto valor añadido.

Esta tesis tiene como objetivo ampliar las capacidades de predicción de BINDSCAN, un protocolo computacional para la ingeniería de proteínas desarrollado originalmente en el Laboratorio de Bioquímica de IQS School of Engineering. El protocolo se basa en el análisis mutacional masivo de la secuencia de proteína para la identificación de posiciones sensibles al reconocimiento de ligandos. En esta tesis hemos: i) implementado nuevas métricas basadas en mediciones de afinidad de unión y cálculos de potencial electrostático, ii) optimizado el rendimiento computacional, iii) implementado una interfaz gráfica para el análisis de resultados y iv) aplicado la nueva versión del protocolo a diferentes GH de interés.

Hemos demostrado que las GH han evolucionado para generar un gradiente de potencial electrostático en su centro activo complementario a la separación de cargas desarrollada en el enlace glicosídico escindible durante la catálisis. Esto nos ha permitido desarrollar una nueva métrica electrostática capaz de identificar residuos cruciales para estabilizar el estado de transición de la reacción. Esta métrica se ha utilizado para cribar diferentes GH: i) 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis (BlβGluc), ii) α-L-arabinofuranosidasa de Thermobacillus xylanilyticus (TxAbf), iii) β-glicosidasa de Spodoptera frugiperda (SfβGly) y iv) lacto-N-biosidasa de Bifidobacterium bifidum (BbLnbB). Los resultados han demostrado que esta métrica predice eficazmente las posiciones que afectan la actividad hidrolítica, por ejemplo, M58A en BlβGluc, R69H en TxAbf y W394F en BbLnbB. Además, hemos validado el rendimiento de clasificación de las diferentes métricas del protocolo BINDSCAN frente a datos experimentales masivos de SfβGly. También proponemos una estrategia computacional basada en el protocolo BINDSCAN para guiar el diseño de transglicosidasas eficientes, mejorando la unión a la molécula aceptora y limitando la actividad hidrolítica natural. Campañas de cribado exitosas con TxAbf y BbLnbB han demostrado la capacidad del protocolo para identificar variantes de GH con altos rendimientos de transglicosidación: TxAbf R69H (7,3%) y BbLnbB W394F (32%), H263A (21%).

Esta tesis contribuye a acortar la distancia entre el diseño teórico y la validación experimental para ampliar las capacidades de la ingeniería enzimática en aplicaciones industriales y biotecnológicas.

Enzyme engineering has revolutionized the expansion of natural enzyme functions, enabling the development of novel biocatalysts with tunable properties for diverse applications. This thesis focuses on advancing computational methodologies to optimize enzymatic performance, especially for the engineering of glycoside hydrolases (GH). GHs catalyze the hydrolytic cleavage of the glycosidic bond in glycans and glycoconjugates. In the past years, efforts have been made to reengineer GH enzymatic function towards transglycosylation activity to catalyze the synthesis of glycosidic linkages for the production of added-value carbohydrate compounds.

This thesis aims to expand the prediction capabilities of BINDSCAN, a computational protocol for protein engineering originally developed at the Laboratory of Biochemistry at IQS School of Engineering. The protocol is based on massive mutational analysis of the protein sequence for the identification of positions sensible to ligand recognition. Here, we have: i) implemented novel metrics based on binding affinity measurements and electrostatic potential calculations, ii) optimized the computational performance, iii) deployed a graphical user interface for results analysis, and iv) applied the new version of the protocol to different GH of interest.

We have demonstrated that GHs have evolved to generate an electrostatic potential gradient at their active site complementary to the charge separation developed at the scissile glycosidic bond during catalysis. This has allowed us to develop a novel electrostatic metric capable of identifying residues crucial to stabilizing the transition state of the reaction. The metric has been used to screen different GHs: i) Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase (BlβGluc), ii) Thermobacillus xylanilyticus α-L-arabinofuranosidase (TxAbf), iii) Spodoptera frugiperda β-glycosidase (SfβGly) and iv) Bifidobacterium bifidum lacto-N-biosidase (BbLnbB). Results have demonstrated that this metric effectively predicts positions affecting hydrolytic activity such as M58A in BlβGluc, R69H in TxAbf, and W394F in BbLnbB. Additionally, we have validated the classification performance of the different metrics of the BINDSCAN protocol against massive experimental data of SfβGly.

We propose a computational strategy based on the BINDSCAN protocol to guide the design of efficient transglycosidases by improving the binding for the acceptor molecule and hampering the natural hydrolytic activity. Successful screening campaigns on TxAbf and BbLnbB have demonstrated the ability of the protocol to identify GH variants with high transglycosylation yields: TxAbf R69H (7.3%) and BbLnbB W394F (32%), H263A (21%).

This thesis contributes to bridging the gap between theoretical design and experimental validation to expand the capabilities of enzyme engineering for industrial and biotechnological applications.