Synergistic RNA-based Targeted Nanotherapies: a Novel Approach for Treating Ascending Aortic Aneurysms in Marfan Syndrome

Abstract

La dilatació progressiva dels aneurismes de l’aorta ascendent eventualment culmina en dissecció i ruptura, representant la principal causa de mortalitat en individus amb síndrome de Marfan. Aquesta malaltia genètica del teixit connectiu és causada per mutacions en el gen de la fibrilina-1, que comprometen la integritat elàstica de la paret aòrtica. Tot i que les intervencions mèdiques i quirúrgiques tenen com a objectiu controlar el creixement de l’aneurisma i prevenir conseqüències potencialment mortals, actualment no proporcionen una solució definitiva. En els darrers anys, les estratègies terapèutiques dirigides als mecanismes patològics involucrats en la progressió de la malaltia aòrtica en la síndrome de Marfan han despertat un interès creixent. L’avenç de la teràpia gènica ha revelat enfocaments terapèutics prometedors. Tanmateix, aspectes clau d’aquestes teràpies, inclosos els seus sistemes d’alliberament, encara requereixen optimització per assolir una aplicació clínica exitosa.

Davant d’aquesta necessitat, aquesta tesi doctoral proposa l’ús sinèrgic de dues teràpies basades en ARN amb l’objectiu de silenciar localment la fibrilina-1 endògena, la proteïna defectuosa de la matriu extracel·lular en la síndrome de Marfan, i reemplaçar-la per una forma exògena i funcional de la proteïna. L’objectiu és restaurar la funcionalitat de les microfibril·les i mantenir la homeòstasi de la paret aòrtica, prevenint o detenint el creixement de l’aneurisma. Per afrontar els reptes associats a l’alliberament de l’ARN, es planteja el desenvolupament d’un sistema d’alliberament que permeti l’administració localitzada de la càrrega, aprofitant les propietats magnètiques i polimèriques dels components del sistema.

Amb aquest propòsit, s’han desenvolupat dues formulacions polimèriques encapsulant ARN d’interferència petit (ARNip) o ARN missatger (ARNm), utilitzant polímers poli(β -aminoèsters) modificats amb oligopèptids, que han emergit com a vectors eficaços i biocompatibles per a la transferència d’àcids nucleics. Mitjançant l’optimització i caracterització exhaustiva dels candidats, s’han obtingut dues formulacions finals amb paràmetres òptims per a l’alliberament d’àcids nucleics. Aquests prototips basats en ARN han demostrat una eficient inhibició i sobreexpressió de fibrilina-1 in vitro, tant a nivell d’ARNm com de proteïna.

Per tal de permetre l’alliberament dirigit de les nanopartícules polimèriques a la paret aòrtica, s’han explorat diferents estratègies. L’objectiu fou conjugar les formulacions polimèriques amb nanopartícules d’òxid de ferro, aprofitant les seves propietats magnètiques per dirigir de manera precisa les partícules cap al lloc d’interès. De manera destacada, s’ha desenvolupat una nova plataforma magnètica basada en polímers, que permet la conjugació covalent dels polímers poli(β -aminoèsters) amb nanopartícules d’òxid de ferro funcionalitzades mitjançant glutaraldehid. Les nanopartícules funcionalitzades han estat posteriorment optimitzades, donant lloc a un sistema de lliurament eficient, capaç d’encapsular àcids nucleics en partícules de mida nanomètrica i de lliurar-ne la càrrega in vitro sota la influència d’un camp magnètic extern.

En conclusió, s’ha desenvolupat una nanoteràpia sinèrgica basada en ARN com a prova de concepte, amb un enfocament particular en l’optimització del seu sistema d’alliberament. Aquesta tesi estableix les bases per a futures investigacions orientades al desenvolupament d’una estratègia terapèutica innovadora que permeti actuar selectivament sobre la fibrilina-1 per tal de restaurar la funcionalitat de la paret aòrtica en la síndrome de Marfan, amb l’objectiu final de prevenir la formació d’aneurismes aòrtics.

La dilatación progresiva en los aneurismas de la aorta ascendente eventualmente culmina en disección y ruptura, representando la principal causa de mortalidad en individuos con síndrome de Marfan. Esta enfermedad genética del tejido conectivo está causada por mutaciones en el gen de la fibrilina-1, las cuales comprometen la integridad elástica de la pared aórtica. A pesar de que las intervenciones médicas y quirúrgicas tratan de controlar el crecimiento del aneurisma y prevenir desenlaces potencialmente mortales, actualmente no ofrecen una solución definitiva. En los últimos años, estrategias terapéuticas dirigidas a los mecanismos patológicos implicados en la progresión de la enfermedad aórtica en el síndrome de Marfan han cobrado un interés significativo. El auge de la terapia génica ha desvelado enfoques terapéuticos prometedores. Sin embargo, aspectos clave de estas terapias, incluidos sus sistemas de administración, aún requieren optimización para su exitosa aplicación clínica.

Ante esta necesidad, esta tesis doctoral propone el uso sinérgico de dos terapias basadas en ARN con el objetivo de silenciar localmente la fibrilina-1 endógena, la proteína defectuosa de la matriz extracelular en el síndrome de Marfan, y reemplazarla por una forma exógena funcional de dicha proteína. El objetivo es restaurar la funcionalidad de las microfibrillas y mantener la homeostasis de la pared aórtica, previniendo o deteniendo el crecimiento del aneurisma. Para abordar los desafíos asociados con la administración de ARN, se plantea el desarrollo de un sistema de liberación que permita la administración localizada del material genético, aprovechando las propiedades magnéticas y poliméricas de los componentes del sistema.

Con este propósito, se han desarrollaron dos formulaciones poliméricas encapsulando ARN pequeño de interferencia (ARNpi) o ARN mensajero (ARNm), utilizando polímeros poli(β -aminoésteres) modificados con oligopéptidos, los cuales han emergido como vectores eficaces y biocompatibles para la administración de ácidos nucleicos. A través de la optimización y caracterización exhaustiva de los candidatos, se han obtenido dos formulaciones finales con parámetros óptimos para la administración de ácidos nucleicos. Estos prototipos basados en ARN han demostrado in vitro una eficiente reducción y sobreexpresión de fibrilina-1, tanto a nivel de ARNm como de proteína.

Para permitir la administración dirigida de las nanopartículas poliméricas a la pared aórtica, se han explorado distintas estrategias. El objetivo fue conjugar las formulaciones poliméricas con nanopartículas de óxido de hierro, aprovechando sus propiedades magnéticas para dirigir de forma precisa las partículas hacia la localización deseada. De forma destacada, se ha desarrollado una nueva plataforma magnética basada en polímeros, que ha permitido la conjugación covalente de los polímeros de poli(β -aminoésteres) con nanopartículas de óxido de hierro funcionalizadas mediante glutaraldehído. Las nanopartículas funcionalizadas han sido posteriormente optimizadas, dando lugar a un sistema de liberación capaz de encapsular ácidos nucleicos en partículas de tamaño nanométrico, y de liberar su carga in vitro bajo la influencia de un campo magnético externo.

En conclusión, se ha desarrollado una nanoterapia sinérgica basada en ARN como prueba de concepto, con un enfoque particular en la optimización de su sistema de administración dirigida. Este trabajo sienta las bases para futuras investigaciones orientadas al desarrollo de una estrategia terapéutica innovadora que permita modular selectivamente la fibrilina-1 para restaurar la funcionalidad de la pared aórtica en el síndrome de Marfan, con el objetivo de prevenir la formación de aneurismas aórticos.

Progressive dilation in ascending aortic aneurysms eventually culminates in dissection and rupture, representing the primary cause of mortality in individuals with Marfan syndrome. This genetic disease of the connective tissue is caused by mutations in the fibrillin-1 gene, which compromise the elastic integrity of the aortic wall. Despite medical and surgical interventions aim to control aneurysm growth and prevent life-threatening outcomes, they currently do not provide a definitive solution. In recent years, therapeutic strategies targeting the pathological mechanisms involved in the progression of aortic disease in Marfan syndrome have gained significant attention. The rise of gene therapy has unveiled promising treatment approaches. However, key aspects of these therapies, including their delivery systems, still require optimization for successful clinical translation.

Given the current need, this doctoral thesis proposes the synergistic use of two distinct RNA-based therapies to locally silence native fibrillin-1, the defective protein of the extracellular matrix in Marfan syndrome, and replace it with an exogenous functional form of the protein. The goal is to restore microfibril functionality and maintain homeostasis of the aortic wall, preventing or halting aneurysm growth. To address the challenges associated with RNA delivery, we aim to develop a delivery system that enables localized delivery of the cargo, utilizing the magnetic and polymeric attributes of the system components.

To achieve this, two polymeric formulations encapsulating small interfering RNA or messenger RNA were developed using oligopeptide-modified poly(β-amino ester)s polymers, which have emerged as effective and biocompatible nucleic acid delivery vectors. Through optimization and comprehensive characterization of the candidates, two final polymeric formulations with optimal parameters for nucleic acid delivery were obtained. These RNA-based prototypes demonstrated efficient in vitro knockdown and overexpression of fibrilin-1 at the mRNA and protein levels.

To enable targeted delivery of the polymeric nanoparticles to the aortic wall, different strategies were explored. The objective was to conjugate the polymeric formulations with iron oxide nanoparticles, exploiting their magnetic properties to precisely direct the particles to the target location. Notably, a novel polymer-based magnetic platform was developed, facilitating covalent conjugation of poly(β-amino ester)s polymers with tailored iron oxide nanoparticles through glutaraldehyde. The functionalized nanoparticles were further refined, resulting in an efficient delivery system capable of encapsulating nucleic acids into nanometric particles, with the capacity to deliver their cargo in vitro under the influence of an external magnetic field.

In conclusion, we have developed a proof-of-concept RNA-based synergistic nanotherapy with particular focus on optimizing its targeted delivery system. This work lays the foundation for future research aimed at developing a novel therapeutic strategy selectively targeting fibrillin-1 to restore the functionality of the aortic wall in Marfan syndrome, with the ultimate goal of preventing aortic aneurysms.