Development of hybrid adeno-associated viral vectors for enhanced gene delivery in Duchenne muscular dystrophy

Abstract

La distròfia muscular de Duchenne (DMD) és un trastorn genètic causat per mutacions en el gen de la distrofina, que provoca una degeneració muscular progressiva, complicacions potencialment mortals i una esperança de vida significativament reduïda. Actualment, no existeix una cura per a aquesta malaltia, i malgrat els avenços, desafiaments com les respostes immunitàries, l’eficiència limitada en l’administració i la manca d’especificitat en les teràpies actuals requereixen estratègies innovadores per millorar els resultats terapèutics.

Aquesta investigació doctoral se centra en el desenvolupament de vectors híbrids que combinen virus adenoassociats (AAV) amb recobriments de poli(β-amino èsters) (pBAE). L’objectiu del recobriment és millorar l’eficiència de transducció dels AAV, augmentar l’especificitat de l’orientació i minimitzar les respostes immunitàries. Un procés sistemàtic avalua aquests vectors híbrids mitjançant estudis in vitro i in vivo.

Primer, es sintetitza una biblioteca de pBAEs modificats amb èsters de N-hidroxisuccinimida (NHS), permetent la seva unió covalent a les càpsides dels AAV. Els experiments inicials in vitro amb gens reporters avaluen l’eficiència de transducció, la biocompatibilitat i l’estabilitat del recobriment. A més, s’explora la incorporació de pèptids de senyalització específics del múscul en els recobriments polimèrics per millorar l’especificitat tissular. Així mateix, s’optimitzen les tècniques de purificació dels vectors híbrids per garantir la funcionalitat de les partícules d’AAV recobertes. Aquests estudis identifiquen el polímer R com el candidat més prometedor per a proves posteriors.

En segon lloc, els vectors AAV recoberts amb polímer R es validen en models in vitro específics de DMD, mostrant una millora en l’eficiència de transducció. En estudis in vivo posteriors amb ratolins mdx, les injeccions intramusculars al tibialis anterior (TA) mostren que aquests vectors híbrids augmenten significativament l’expressió de distrofina als músculs tractats, recolzant el seu potencial terapèutic.

Les futures línies de recerca inclouen optimitzar el recobriment polimèric per millorar la seva durabilitat i evasió immune, estudiar amb més detall les respostes immunitàries i explorar maneres de perfeccionar l’entrega sistèmica. En millorar els mecanismes d’administració gènica, aquesta investigació posa les bases per avançar en tractaments més segurs i eficaços per a la DMD i altres trastorns genètics.

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es un trastorno genético causado por mutaciones en el gen de la distrofina, que conduce a una degeneración muscular progressiva, complicaciones potencialmente mortales y una esperanza de vida significativamente reducida. Actualmente, no existe cura para esta enfermedad, y a pesar de los avances, desafíos como las respuestas inmunitarias, la eficiencia limitada de administración y la falta de especificidad en las terapias existentes requieren estrategias innovadoras para mejorar los resultados terapéuticos.

Esta investigación doctoral se centra en el desarrollo de vectores híbridos que combinan virus adenoasociados (AAV) con recubrimientos de poli(β-amino ésteres) (pBAE). El objetivo del recubrimiento es mejorar la eficiencia de transducción del AAV, aumentar la especificidad de la orientación y minimizar las respuestas inmunes. Un proceso sistemático evalúa estos vectores híbridos a través de estudios in vitro e in vivo.

Primero, se sintetiza una biblioteca de pBAEs modificados con ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS), lo que permite su unión covalente a las cápsides del AAV. Los experimentos iniciales in vitro con genes reporteros evalúan la eficiencia de transducción, la biocompatibilidad y la estabilidad del recubrimiento. Además, se explora la incorporación de péptidos de señalización específicos del músculo en los recubrimientos poliméricos para mejorar la especificidad tisular. Asimismo, se optimizan las técnicas de purificación de los vectores híbridos para garantizar la funcionalidad de las partículas de AAV recubiertas. Estos estudios identifican al polímero R como el candidato más prometedor para pruebas adicionales.

En segundo lugar, los vectores AAV recubiertos con polímero R se validan en modelos in vitro específicos de DMD, mostrando una mejora en la eficiencia de transducción. En estudios in vivo posteriores con ratones mdx, las inyecciones intramusculares en el tibialis anterior (TA) muestran que estos vectores híbridos aumentan significativamente la expresión de distrofina en los músculos tratados, respaldando su potencial terapéutico.

Las futuras líneas de investigación incluyen optimizar el recubrimiento polimérico para mejorar su durabilidad y evasión inmune, estudiar las respuestas inmunes con mayor detalle y explorar formas de refinar la entrega sistémica. Al mejorar los mecanismos de administración génica, esta investigación sienta las bases para avanzar en tratamientos más seguros y efectivos para la DMD y otros trastornos genéticos.

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a genetic disorder caused by mutations in the dystrophin gene, leading to progressive muscle degeneration, life-threatening complications and significantly reduced life expectancy. There is currently no cure for this disease, and despite advancements, challenges such as immune responses, limited delivery efficiency, and lack of specificity in existing therapies necessitate innovative strategies to improve therapeutic outcomes.

This doctoral research focuses on the development of hybrid vectors combining adeno-associated virus (AAV) with poly(β-amino ester) (pBAE) coatings. The coating aims to enhance AAV transduction efficiency, improve targeting specificity, and minimize immune responses. A systematic process evaluates these hybrid vectors through in vitro and in vivo studies.

First, a library of pBAEs modified with N-hydroxysuccinimide (NHS) esters is synthesized, allowing covalent attachment to AAV capsids. Initial in vitro experiments with reporter genes are conducted to assess transduction efficiency, biocompatibility, and coating stability. The study also explores the incorporation of muscle-specific signaling peptides into the polymer coatings to enhance tissue specificity. Furthermore, purification techniques for hybrid vectors are optimized to ensure the functionality of the coated AAV particles. These studies identify R polymer as the most promising candidate for further testing.

Second, R polymer-coated AAV vectors are validated in DMD-specific in vitro models, demonstrating improved transduction efficiency. In subsequent in vivo studies using mdx mice, intramuscular injections into the tibialis anterior (TA) reveal that these hybrid vectors significantly enhance dystrophin expression in treated muscles, supporting their therapeutic potential.

Future directions include optimizing the polymeric coating to enhance durability and immune evasion, studying immune responses in greater detail, and exploring ways to refine systemic delivery. By improving gene delivery mechanisms, this research provides a foundation for advancing safer and more effective treatments for DMD and other genetic disorders.