Exploring extracellular vesicles in glomerular disease: biomarkers, large-scale production and therapeutic insights from a miniature swine model of experimental Adriamycin-induced nephropathy

Abstract

La malaltia renal crònica (MRC), especialment les glomerulopaties com la glomeruloesclerosi focal i segmentària (GEFS), continua sent un repte clínic degut a la manca de biomarcadors no invasius fiables i tractaments efectius. Aquesta tesi investiga el potencial de les vesícules extracel·lulars (EVs) tant com a eines diagnòstiques com terapèutiques, combinant l’anàlisi d’EVs urinàries (uEVs) per a la identificació de biomarcadors amb el desenvolupament de bioteràpies basades en EVs derivades de cèl·lules mesenquimals estromals (MSC-EVs), utilitzant models preclínics avançats. En la primera part, es caracteritzen les uEVs com a font no invasiva de biomarcadors. Mitjançant estudis proteòmics i metabolòmics, es van identificar signatures moleculars específiques de la GEFS, incloent-hi proteïnes immunològiques, activació del complement i alteracions metabòliques. Un biomarcador prometedor es va validar mitjançant ELISA, mostrant una expressió elevada en pacients amb MRC, independentment del filtratge glomerular o la proteinúria. Això reforça el valor diagnòstic de les uEVs i millora la comprensió dels mecanismes inflamatoris i compensatoris de la malaltia. La segona part presenta una plataforma escalable per a la producció de MSC-EVs mitjançant cèl·lules immortalitzades (iMSCs) cultivades en un bioreactor de fibra buida (HFB). Aquest sistema soluciona problemes habituals de la producció convencional, com la baixa rendibilitat i la variabilitat, mantenint la puresa, consistència funcional i baixa immunogenicitat de les EVs. Les iMSC-EVs generades al HFB van demostrar capacitat angiogènica in vitro i un perfil molecular comparable a les EVs de cultius 2D. El sistema permet una producció escalable i compatible amb GMP per a aplicacions terapèutiques futures. Finalment, es va desenvolupar un nou model porcí de nefropatia per adriamicina (AN) que reprodueix característiques de lesions glomerulars inicials com dany podocitari, albuminúria i fibrosi. Es va explorar la detecció d’ARNm de podòcits en orina (NPHS1, NPHS2, PODXL, etc.) com a eina de seguiment no invasiu. Les MSC-EVs produïdes al HFB van mostrar efectes protectors sobre els podòcits in vitro i in vivo, millorant la viabilitat cel·lular i reduint la permeabilitat a l’albúmina. També es va observar una major acumulació renal de MSC-EVs en animals amb dany, destacant el seu potencial terapèutic localitzat. Aquestes EVs contribueixen a la modulació de la inflamació, la fibrosi i la reparació cel·lular, alhora que responen a la necessitat de sistemes de producció eficients. En conclusió, aquesta tesi demostra el doble valor de les EVs com a biomarcadors no invasius i com a agents terapèutics innovadors en la MRC. L’estudi de les uEVs proporciona una eina potent per a la detecció precoç i el seguiment de la malaltia, mentre que la producció escalable de MSC-EVs obre la porta a noves aplicacions clíniques en medicina regenerativa i diagnòstic de precisió.

La enfermedad renal crónica (ERC), en particular las glomerulopatías como la glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GEFS), continúa representando un desafío clínico significativo debido a la falta de biomarcadores no invasivos precisos y opciones terapéuticas efectivas. Esta tesis explora el potencial de las vesículas extracelulares (EVs) tanto como herramientas diagnósticas como terapéuticas para abordar estas necesidades no cubiertas, combinando el descubrimiento de biomarcadores a través del análisis de EVs urinarias (uEVs) con el desarrollo de bioterapias derivadas de células mesenquimales estromales (MSC-EVs) utilizando modelos preclínicos avanzados. La primera parte de esta tesis se centra en la caracterización de las uEVs como fuente no invasiva de biomarcadores. A través de perfiles proteómicos y metabolómicos, identificamos firmas moleculares distintas en GEFS, incluyendo un enriquecimiento de proteínas inmunológicas, activación del complemento, lipoproteínas y alteraciones metabólicas como en los aminoácidos y la vía de la nicotinamida. En particular, se validó un biomarcador prometedor mediante un ensayo ELISA con potencial clínico. Su expresión se encontró elevada en ERC, independientemente de la tasa de filtrado glomerular o la proteinuria, destacando su potencial para la detección temprana y la estratificación de la enfermedad. Estos hallazgos refuerzan el valor diagnóstico de las uEVs y aportan una mayor comprensión sobre la fisiopatología de la GEFS, especialmente en relación con la inflamación y los mecanismos de compensación renal. En la segunda parte, se desarrolló una plataforma escalable para la producción de MSC-EVs mediante el cultivo de MSCs inmortalizadas (iMSCs) en un biorreactor de fibra hueca (HFB). Este sistema superó limitaciones clave de la producción convencional de EVs, como la variabilidad entre lotes y el bajo rendimiento, manteniendo la pureza, baja inmunogenicidad y consistencia funcional de las EVs. Las iMSC-EVs producidas en el HFB indujeron angiogénesis in vitro y presentaron un perfil molecular comparable al de las EVs derivadas de cultivos 2D, validando el potencial traslacional de esta plataforma. Además, las condiciones de cultivo controladas y el uso estratégico de medios combinados dentro del HFB permitieron una solución rentable y adaptable a GMP para la fabricación a gran escala de EVs terapéuticas. La parte final de la tesis presenta el desarrollo de un modelo porcino novedoso de nefropatía por adriamicina (AN) como un sistema clínicamente relevante para estudiar enfermedades glomerulares y probar terapias basadas en MSC-EVs. Este modelo reprodujo características clave de una lesión glomerular en etapa temprana, incluyendo daño podocitario, albuminuria y fibrosis. Se exploró la detección de ARNm específico de podocitos en orina (NPHS1, NPHS2, PODXL, entre otros) como una estrategia no invasiva de monitoreo. Importante, las MSC-EVs derivadas del sistema HFB mostraron efectos protectores sobre los podocitos tanto in vitro como in vivo, restaurando la viabilidad celular y reduciendo la permeabilidad a la albúmina. Los estudios de biodistribución revelaron una mayor acumulación renal de MSC-EVs en animales con daño glomerular, lo cual respalda su potencial como terapia localizada. Estos hallazgos refuerzan el rol de las MSC-EVs en la modulación de la inflamación, la fibrosis y la reparación podocitaria, al mismo tiempo que abordan la necesidad de estrategias eficaces de entrega y sistemas de producción escalables. En conclusión, esta tesis demuestra el doble potencial de las vesículas extracelulares como biomarcadores no invasivos y como agentes terapéuticos avanzados en la enfermedad renal. El perfilado de uEVs ofrece una herramienta poderosa y no invasiva para la detección temprana y el monitoreo de la enfermedad, mientras que la producción escalable y la validación funcional de las MSC-EVs sientan las bases para futuras aplicaciones clínicas. En conjunto, los resultados respaldan un cambio de paradigma hacia estrategias basadas en EVs en nefrología, con implicaciones prometedoras para el diagnóstico de precisión y la medicina regenerativa.

Chronic kidney disease (CKD), particularly glomerular diseases such as focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), remains a major clinical challenge due to the lack of accurate, non-invasive biomarkers and effective therapeutic options. This thesis explores the potential of extracellular vesicles (EVs) as both diagnostic and therapeutic tools to address these unmet needs, combining biomarker discovery through urinary EV (uEV) analysis and the development of mesenchymal stromal cell-derived EV (MSC-EV) biotherapeutics using advanced preclinical models. The first part of this thesis focuses on the characterization of uEVs as a non-invasive source of biomarkers for FSGS. Through proteomic and metabolomic profiling, we identified distinct molecular signatures in FSGS patients, including an enrichment of immunological proteins, complement activation, lipoproteins, and metabolic disruptions, such as altered amino acid and nicotinamide pathways. Notably, one protein was validated as a promising biomarker using a clinically translatable ELISA assay. Its expression was elevated in CKD patients, independent of glomerular filtration rate or proteinuria, indicating its potential utility for early-stage detection and disease stratification. These findings underscore the diagnostic value of uEVs and contribute to a deeper understanding of FSGS pathophysiology, particularly regarding inflammation and compensatory renal mechanisms. In the second component of this work, we established a scalable platform for the continuous production of high-quality MSC-EVs using immortalized MSCs (iMSCs) cultured in a hollow fiber bioreactor (HFB). This system overcame key limitations of conventional EV production, such as batch variability and low yield, while maintaining EV purity, low immunogenicity, and functional consistency. iMSC-EVs produced in the HFB induced angiogenesis in vitro and exhibited a comparable molecular profile to EVs derived from 2D cultures, validating the platform’s translational potential. Furthermore, the controlled culture conditions and novel medium configuration within the HFB enabled a cost-effective and GMP-adaptable solution for the large-scale manufacturing of therapeutic EVs. The final part of the thesis presents the development of a novel swine model of Adriamycin nephropathy (AN) as a clinically relevant system for studying glomerular disease and testing MSC-EV therapies. This model reproduced key features of early-stage glomerular injury, including podocyte damage, albuminuria, and fibrosis. Urinary detection of podocyte-specific mRNA (e.g., NPHS1, NPHS2, PODXL) was explored as a non-invasive monitoring strategy. Importantly, MSC-EVs derived from the HFB production system demonstrated protective effects on podocytes both in vitro and in vivo, restoring cell viability and reducing albumin permeability. Biodistribution studies further revealed increased renal accumulation of MSC-EVs in animals with glomerular injury, emphasizing the potential of localized EV therapies. These findings reinforce the role of MSC-EVs in modulating inflammation, fibrosis, and podocyte repair, while also addressing the need for effective delivery strategies and scalable production systems. In conclusion, this thesis demonstrates the dual potential of extracellular vesicles as both non-invasive biomarkers and advanced therapeutic agents in kidney disease. Urinary EV profiling offers a powerful, non-invasive tool for early detection and disease monitoring, while the scalable production and functional validation of MSC-EVs lay the foundation for future clinical applications. Collectively, the findings support a paradigm shift toward EV-based strategies in nephrology, with promising implications for precision diagnostics and regenerative medicine.