Ubiquitin dependent control of RNA polymerase I by blocks in transcriptional elongation

Abstract

Durant la transcripció, les ARN polimerases poden troben obstacles, tals com lesions en l'ADN, capaces d’aturar l’elongació. Aquests bloquejos són especialment perjudicials, ja que poden inhibir l'expressió gènica i comprometre la integritat del genoma. Mentre que les respostes cel·lulars a aquest estrès transcripcional han estat àmpliament estudiades per a l’ARN polimerasa II, actualment desconeixem com respon l’ARN polimerasa I (ARN Pol I) a desafiaments similars. Cal destacar que l’ARN Pol I representa més del 60% de l'activitat transcripcional total de les cèl·lules eucariotes, és responsable de la síntesi de l’ARN ribosòmic (ARNr) i, per tant, resulta essencial per a la biogènesi dels ribosomes i la síntesi de proteïnes. En aquest estudi, hem caracteritzat diverses subunitats de l’ARN Pol I, prèviament identificades en una anàlisi proteòmica com a dianes d’ubiqüitinació dependents de Nse1. Nse1 és una subunitat del complex Smc5/6, un factor necessari per a la integritat genòmica que participa en la segregació de l’ADN ribosòmic (ADNr). En aquesta tesi, hem validat que Rpa190, la subunitat més gran de l’ARN Pol I, és ubiqüitinada als residus K408 i K410, situats al domini clamp de la polimerasa, en un procés dependent de Nse1 i dels enzims E2 conjugadors d’ubiqüitina Rad6 i Cdc34, i contrarestat per la desubiqüitinasa Ubp10. Aquesta modificació s’intensifica davant de lesions a l’ADNr, així com amb l’inhibidor específic de l’ARN Pol I BMH-21, relacionant la ubiqüitinació de Rpa190 amb bloquejos de l’elongació transcripcional. A més, les nostres observacions suggereixen que els complexos d’ARN Pol I encallats són processats per la segregasa Cdc48, en cooperació amb els seus cofactors Ubx4 i Ubx5, cosa que permet la degradació proteasomal de les seves dues subunitats més grans. Paral·lelament, Cdc48 també podria contribuir a mantenir els nivells d’ubiqüitinació de Rpa190, evitant una activitat excessiva d’Ubp10. Finalment, els nostres resultats indiquen que la ubiqüitinació de Rpa190 afavoreix la correcta disjunció de l’ADNr, ja que redueix els defectes de segregació de l’ADNr observats en mutants smc5/6. Tot i que la ubiqüitinació de Rpa190 s’indueix en resposta a estrès transcripcional, l’anàlisi d’un al·lel de Rpa190 amb fusions de cadenes d’ubiqüitina al domini clamp mostra que la seva ubiqüitinació constitutiva resulta perjudicial per a la supervivència cel·lular, indicant que aquesta modificació ha de ser transitòria i estar estrictament regulada. En conjunt, els nostres resultats estableixen la ubiqüitinació de Rpa190 com un mecanisme regulador clau per al control de l’activitat d’ARN Pol I en resposta a bloquejos en l’elongació induïts per inhibidors de la transcripció i lesions a l’ADN, que d’altra manera podrien interferir amb altres transaccions cromosòmiques en l’ADNr.

Durante la transcripción, las ARN polimerasas pueden encontrar obstáculos, como lesiones en el ADN, que pueden detener la elongación. Estos bloqueos son especialmente perjudiciales, ya que pueden inhibir la expresión génica y comprometer la integridad del genoma. Mientras que las respuestas celulares a este estrés transcripcional han sido ampliamente estudiadas para la ARN polimerasa II, se conoce mucho menos sobre cómo responde la ARN polimerasa I (ARN Pol I) a desafíos similares. Cabe destacar que la ARN Pol I representa más del 60% de la actividad transcripcional total en células eucariotas, es responsable de la síntesis del ARN ribosómico (ARNr) y, por tanto, resulta esencial para la biogénesis de los ribosomas y la síntesis de proteínas. En este estudio, hemos caracterizado varias subunidades de la ARN Pol I, previamente identificadas en un análisis proteómico como dianas de ubiquitinación dependientes de Nse1. Nse1 es una subunidad del complejo Smc5/6 implicada en la segregación del ADN ribosómico (ADNr). En esta tesis, hemos validado que Rpa190, la subunidad más grande de la ARN Pol I, es ubiquitinada en los residuos K408 y K410, localizados en el dominio clamp de la polimerasa, en un proceso dependiente de Nse1 y de las enzimas E2 conjugadoras de ubiquitina Rad6 y Cdc34, y contrarrestado por la desubiquitinasa Ubp10. Esta modificación aumenta ante lesiones en el ADNr, así como con el inhibidor específico de ARN Pol I BMH-21, relacionando la ubiquitinación de Rpa190 con bloqueos en la elongación transcripcional. Además, nuestras observaciones sugieren que los complejos de ARN Pol I parados son procesados por la segregasa Cdc48, en cooperación con sus cofactores Ubx4 y Ubx5, permitiendo así la degradación proteasomal de sus dos subunidades más grandes. Paralelamente, Cdc48 podría contribuir a mantener la ubiquitinación de Rpa190, evitando una actividad excesiva de Ubp10. Finalmente, nuestros resultados indican que la ubiquitinación de Rpa190 facilita la disyunción del ADNr, ya que alivia los defectos en la segregación del ADNr observados en mutantes smc5/6. Si bien la ubiquitinación de Rpa190 se induce como respuesta al estrés transcripcional, el análisis de un alelo de Rpa190 con fusiones de cadenas de ubiquitina en el dominio clamp revela que su ubiquitinación constitutiva resulta perjudicial para la supervivencia celular, lo que indica que esta modificación debe ser transitoria y estar estrictamente regulada. En conjunto, nuestros hallazgos establecen la ubiquitinación de Rpa190 como un mecanismo regulador clave para el control de la actividad de ARN Pol I frente a bloqueos en la elongación inducidos por inhibidores de la transcripción y daños en el ADN, que de otro modo podrían interferir con ciertas transacciones cromosómicas en el ADNr.

During transcription, RNA polymerases inevitably encounter obstacles such as DNA lesions that can stall elongation. These blocks are particularly harmful, as they may inhibit gene expression and compromise genome integrity. While the cellular responses to such transcriptional stress have been extensively studied for RNA polymerase II, much less is known about how RNA polymerase I (RNA Pol I) responds to similar challenges. Importantly, RNA Pol I accounts for over 60% of total transcriptional activity in eukaryotic cells, is responsible for synthesising ribosomal RNA (rRNA) and is thus essential for ribosome biogenesis and protein synthesis. In this study, we have characterised several RNA Pol I subunits that were previously identified in a proteomic screen as Nse1-dependent ubiquitin targets. Nse1 is a subunit of the Smc5/6 complex, a genome integrity factor that plays essential roles in ribosomal DNA (rDNA) segregation. Notably, we validated that Rpa190, the largest subunit of RNA Pol I, is ubiquitinated at residues K408 and K410, in the clamp domain of the polymerase, in a process dependent on Nse1 and the E2-conjugating enzymes Rad6 and Cdc34, and counteracted by the deubiquitinase Ubp10. This modification is enhanced by lesions on the rDNA, as well as by the specific RNA Pol I inhibitor BMH-21, linking Rpa190 ubiquitination to blocks in transcriptional elongation. Additionally, our observations suggest that stalled RNA Pol I complexes are processed by the Cdc48 segregase, in cooperation with its Ubx4 and Ubx5 cofactors, enabling the proteasomal degradation of its two largest subunits. In parallel, Cdc48 may also contribute to sustain Rpa190 ubiquitination levels by preventing excessive Ubp10 activity. Finally, our results indicate that Rpa190 ubiquitination facilitates proper rDNA disjunction, as it alleviates the rDNA segregation defects observed in smc5/6 mutants. Although Rpa190 ubiquitination is promoted in response to transcriptional stress, analysis of an Rpa190 allele bearing ubiquitin chain fusions at the clamp domain shows that constitutive ubiquitination is detrimental to cell survival, indicating that this modification must be transient and tightly regulated. Overall, our findings establish Rpa190 ubiquitination as a central regulatory mechanism controlling RNA Pol I activity in response to elongation blocks induced by transcription inhibitors and DNA lesions, which may otherwise interfere with other chromosomal transactions at the rDNA.