Cellular and molecular characterization of the circadian electrochemical signals that regulate growth in Arabidopsis thaliana

Abstract

En aquesta tesi doctoral, hem combinat anàlisis moleculars, cel·lulars i fisiològiques per desentranyar els mecanismes mitjançant els quals el component del rellotge circadiari CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) modula diferencialment el creixement d’òrgans específics a Arabidopsis thaliana. Utilitzant un sensor de pH codificat genèticament i un anàleg fluorescent de sacarosa, vam demostrar que CCA1 regula de manera distintiva el pH apoplàstic en diferents tipus cel·lulars. Específicament, CCA1 redueix el pH de l’apoplast en cèl·lules epidèrmiques mentre que l’augmenta en les cèl·lules acompanyants del floema. Aquests gradients electroquímics oposats promouen el creixement de l’hipocòtil però reprimeixen l’elongació de l’arrel. Des del punt de vista mecanístic, CCA1 activa la senyalització de les auxines a la part aèria de la planta mentre que reprimeix directament els gens SUCROSE TRANSPORTER 2 (SUC2) i la bomba de protons electrogènica ATPasa 3 (AHA3) mitjançant la unió als seus promotors. Aquesta repressió redueix la càrrega de sacarosa al floema i disminueix la velocitat del seu transport cap a les arrels. L’expressió específica de CCA1 en cèl·lules acompanyants reprimeix l’elongació de l’arrel, mentre que la sobreexpressió d’AHA3 en plantes que sobreexpressen CCA1 rescata el defecte de creixement radicular de CCA1-ox. Les dades experimentals i els models computacionals suggereixen que CCA1 actuaria com un reòstat, orquestrant senyals electroquímiques per optimitzar temporalment la capacitat dels teixits font per transportar energia fotosintètica en funció de la demanda dels teixits col·lectors, consumidors d’aquesta energia.

En esta Tesis Doctoral, hemos combinado análisis moleculares, celulares y fisiológicos para desentrañar los mecanismos mediante los cuales el componente del reloj circadiano CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) modula diferencialmente el crecimiento de órganos específicos en Arabidopsis thaliana. Utilizando un sensor de pH genéticamente codificado y un análogo fluorescente de sacarosa, demostramos que CCA1 regula distintivamente el pH apoplástico en diferentes tipos celulares. Específicamente, CCA1 reduce el pH del apoplasto en células epidérmicas mientras aumenta el pH en las células acompañantes del floema. Estos gradientes electroquímicos opuestos promueven el crecimiento del hipocotilo pero reprimen la elongación de la raíz. Mecanísticamente, CCA1 activa la señalización de auxinas en la parte aérea de la planta mientras que reprime directamente los genes SUCROSE TRANSPORTER 2 (SUC2) y la bomba de protones electrogénica ATPasa 3 (AHA3) mediante la unión a sus promotores. Esta represión reduce la carga de sacarosa en el floema y disminuye la velocidad de su transporte hacia las raíces. La expresión específica de CCA1 en células acompañantes reprime la elongación de la raíz, mientras que la sobre-expresión de AHA3 en plantas que sobre-expresan CCA1 rescata el defecto de crecimiento radicular de CCA1-ox. Los datos experimentales y modelos computacionales sugieren que CCA1 funcionaría como un reóstato, orquestando señales electroquímicas para optimizar temporalmente la capacidad de los tejidos fuente de transportar energía fotosintética en función de la demanda de los tejidos sumidero, consumidores de esa energía.

In this Doctoral Thesis, we have employed an integrative approach, spanning molecular, cellular, and physiological analyses, to unravel how the circadian clock component CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) modulates organ-specific growth in Arabidopsis thaliana. Using in-vivo imaging tools, including a genetically encoded pH sensor and a fluorescent sucrose analog, we demonstrate that CCA1 opposingly regulates the apoplastic pH in different cell types. Specifically, CCA1 lowers the pH of the apoplast in epidermal cells while increase the apoplastic pH in phloem companion cells. These spatially opposed electrochemical gradients driven by CCA1 promote shoot growth but suppress root elongation. Mechanistically, CCA1 enhances auxin signaling in shoots while directly repressing SUCROSE TRANSPORTER 2 (SUC2) and the electrogenic proton pump ATPase AHA3 by directly binding to their promoters. This repression reduces sucrose loading into the phloem and decreases sucrose transport velocity to the roots. Cell-type-specific expression of CCA1 in the companion cells effectively represses root elongation, while over-expression of AHA3 in CCA1-over-expressing seedlings rescues the CCA1-ox root growth defect. Combining experimental data with computational modeling demonstrates that CCA1 might function as a rheostat, orchestrating electrochemical signals to timely optimize source capacity with sink demand.