Non-Traditional Strategies To Fight Antimicrobial Resistance in Gram-Negative Bacteria: From Cyclic Peptides To Antibacterial Plasmids

Abstract

[eng] With the aging population, the rising burden of neurodegenerative diseases presents a critical public health issue, potentially resulting in an unsustainable social and economic burden if current trends continue. Strikingly, most of these diseases lack a cure or even and effective treatment that improves the quality of life for affected individuals. A hallmark of neurodegenerative disorders is synaptic dysfunction, which arises despite neuronal loss and is driven by the accumulation of misfolded proteins, all leading to molecular, circuitry, and functional impairments (Palop & Mucke, 2016). Yet, the exact mechanisms driving these specific alterations are still not fully understood. This highlights the need for a deeper understanding of these diseases and, more importantly, the urgent need for novel therapeutic strategies, potentially based on modulating brain plasticity.

In the context of this thesis, we focused in two neurodegenerative diseases, Huntington’s Disease (HD) and Alzheimer’s Disease (AD). HD is an autosomal-dominant, genetic, neurodegenerative disorder characterised by progressive degeneration of striatal and cortical regions of the brain (Huntington, 2003; Walker, 2007). The disease manifests with motor deficits such as chorea, dystonia, and incoordination, alongside cognitive decline and psychiatric impairments. HD is caused by a mutation in the huntingtin (HTT) gene, with an expanded CAG trinucleotide repeat resulting in a mutant form of huntingtin (mHTT) that leads to neurodegeneration (The Huntington’s Disease Collaborative Research Group, 1993a). HD is marked by selective neuronal loss and impaired synaptic plasticity, particularly in the cortex and striatum, with medium spiny neurons being especially vulnerable (Vonsattel & DiFiglia, 1998). Disruption of the cortico-striatal pathway, which plays a critical role in motor and cognitive functions, contributes to the disease’s symptoms (Cepeda et al., 2007).AD, on the other hand, is the leading cause of dementia, characterised by progressive memory decline and impairments in language, executive function, and visuospatial skills (Scheltens et al., 2021; Stelzmann et al., 1995). AD is classified into familial, caused by mutations in genes like APP, PSEN1, and PSEN1 with earlier onset accounting for less than 0.5% of cases, and sporadic AD, present in 99,5% of cases and influenced by genetic, environmental, and lifestyle factors (Bateman et al., 2011; Bertram et al., 2010). AD is characterised by amyloid plaques, tau tangles, and neuroinflammation. Synaptic dysfunction, particularly in the hippocampus, correlates strongly with cognitive decline in AD (Querfurth & LaFerla, 2010). Therefore, synaptic plasticity is an early alteration in both diseases, underscoring the need to develop therapeutic strategies that specifically target these early changes.

Synaptic plasticity is the mechanism by which synaptic connections in the brain are strengthened or weakened in response to various stimuli. Impairments in this process are one of the main characteristics in HD and AD, contributing significantly to the functional deficits observed in these conditions (J. Y. Li et al., 2003; Selkoe, 2002). In long term synaptic plasticity, activation of receptors by neurotransmitters triggers signalling pathways that enhance synaptic strength, usually associated to calcium influx. A key component of this

strengthening is the insertion of new receptors into the postsynaptic membrane, a process that requires protein kinases and local protein synthesis. Besides calcium, another key signalling molecule sustaining plasticity is cyclic adenosine monophosphate (cAMP). cAMP is modulated by metabotropic receptor activity, and among diverse targets, activates protein kinase A (PKA), which phosphorylates transcription factors like CREB, initiating gene expression required for long-term synaptic modifications (Benito & Barco, 2010). Furthermore, the cAMP-PKA pathway is essential for establishing structural changes in synapses, and its activation has been linked to enhanced synaptic plasticity in various brain regions (C. C. Huang & Hsu, 2006; Nguyen & Kandel, 1997). Additionally, astrocytes also contribute to synaptic plasticity. However, the mechanisms underlying cAMP contribution to synaptic plasticity are not yet completely understood, neither its specific role in neurons or astrocytes.

Indeed, alterations in cAMP signalling are increasingly linked to aging and neurodegenerative diseases such as HD and AD (Kelly, 2018). Both the cortico-striatal pathway in HD and the hippocampus in AD show disruptions in the cAMP-PKA signalling pathway. In HD, decreased cAMP signalling in the cortex and striatum and increased in the hippocampus have been reported, although with controversies around it. In AD, it is more well-established that cAMP signalling is decreased in the hippocampus, playing a key role in the development of the dementia-related pathology. Due to the still controversial knowledge of cAMP in HD, and the known importance of the cortex in the disease, our first objective is to characterise the disruptions in cortical cAMP signalling and behaviour in the R6/1 mouse model for the disease.

Therefore, approaches aimed at enhancing synaptic plasticity through cAMP signalling modulation hold potential for mitigating or delaying network dysfunction associated with neurodegenerative disorders such as HD and AD. In this regard, optogenetic tools provide precise control of biological mechanisms through light-sensitive proteins. Particularly, photoactivated adenylyl cyclases (PACs) are enzymes that elevate cAMP levels in response to light stimulation, initiated by an AC domain coupled to a photoreceptor module (Iseki & Park, 2021). Among these, DdPAC is a recently optimised PAC that regulates cAMP in response to red light (Stüven et al., 2018). Originally developed in bacteria, DdPAC demonstrated a stronger light response compared to other red-light-sensitive PACs. However, its application in brain cells and in vivo remains unexplored. Considering red light's ability to penetrate tissues with minimal scattering, it is well-suited for non-invasive applications. Given the promising potential of DdPAC as a novel optogenetic tool for modulating cAMP, our second objective is to establish its use for non-invasive modulation of synaptic plasticity in vivo. Further, considering the distinct regional vulnerabilities and pathophysiological differences between HD and AD, which may impact cAMP modulation and synaptic plasticity, our third objective is to restore physiological function through light-driven DdPAC

stimulation in mouse models of both diseases. Importantly, the focus will be set on the regions most affected in each condition, specifically targeting the striatum and cortex in HD, and hippocampus in AD.

In light of this information, the main aim of this thesis is to restore physiological function in neurodegenerative diseases by modulating brain plasticity through light-induced activation of DdPAC-mediated cAMP signalling in specific brain circuits.

To achieve our first objective and characterise the disruptions in cortical cAMP signalling and behaviour in the R6/1 mouse model of Huntington’s Disease, we first assessed cortical cAMP alterations during cortico-striatal behaviours in R6/1 mice. To investigate cAMP dynamics, we performed fibre photometry recordings of the GFlamp-1 sensor, a novel cAMP sensor, in M2 cortical neurons of 14-week-old and 20-week-old WT and R6/1 male and female mice during the beetle-mania (BMT) and accelerating rotarod (ARR) tasks. First, we evaluated cAMP dynamics during the BMT and observed an increase of cAMP levels in both WT and R6/1 mice upon the introduction of the beetle. Despite R6/1 mice already exhibiting altered behaviour during the test, no genotype differences in cAMP levels were detected. These data revealed the involvement of neuronal cAMP signalling during the BMT, with minimal alterations in R6/1 mice. Then, to further understand the contribution of cAMP signalling to M2-cortex related tasks, we explored cAMP dynamics during the ARR. Our results were in line with what we observed during the BMT, as both neuronal cAMP levels from WT and R6/1 mice increased with the start of the task. In contrast of our BMT results, in this case we observed an aberrant overactivation of the M2-cortex in R6/1 mice. Lastly, to better understand if alterations in cAMP activity during M2-cortex related tasks are more prominent at later stages of disease progression, we repeated the BMT in the same cohort of mice at 20 weeks, when mice are fully symptomatic. At this age, we were still able to observe an increase in neuronal cAMP in both WT and R6/1 mice upon the introduction of the beetle. However, the increase in cAMP was significantly diminished in R6/1 mice. Altogether, these results highlight the contribution of neuronal cAMP in M2-cortex related task and display alterations in HD.

Due to the critical role of M2-cortex in HD pathophysiology, we also aimed to determine if additional symptoms associated with cortico-striatal dysfunction emerge at early disease stages of the disease in the R6/1 mouse model. To accomplish this, we selected two behavioural tests, namely the adhesive removal test and the marble-burying test, both related with the M2-cortex and the cortico-striatal pathway, and then performed them longitudinally from 4 to 16-week-old mice. In the removal adhesive test, which is related to the M2-cortex-somatosensory cortex-striatum pathway, we observed fine motor deficits as early as 8 weeks, while somatosensory deficits appeared at 16 weeks. In the marble burying test, which is related to the M2-cortex-orbitofrontal cortex-striatum pathway, we observed anhedonia-like behaviour from 8 weeks. These data indicated that cortico-striatal dysfunction emerges at very early timepoints, highlighting the potential for early therapeutic interventions.

Overall, findings from the first objective indicate that M2 cortex-related cortico-striatal dysfunction emerges at early disease stages, underscoring the potential for early therapeutic interventions. Since neuronal cAMP signalling is remains responsive in behaving mice, it it is unlikely to underlie the M2-related behavioural deficits, suggesting that alternative mechanisms may be responsible for these impairments.

To accomplish our second objective and implement DdPAC as a novel optogenetic tool to non-invasively modulate synaptic plasticity through cAMP signalling, we first aimed to establish a minimally or non-invasive method for the delivery of DdPAC in the brain by using AAVs constructs. Thus, we designed GFP constructs under three different promoters (CAG, CamKIIa, and FLEXon), and administered them using two different AAV serotypes (AAV9 and PHP.eB), into two different mouse strains (C57BL/6J and B6CBA), and via three delivery routes, from more to less invasive (intra-cranial, retro-orbital, and intranasal). In summary, GFP expression was detected in various brain regions and specific cell types following retro-orbital injection of PHP.eB and AAV9 constructs, with the PHP.eB serotype exhibiting broader infection. Furthermore, we were able to express PHP.eB constructs in C57BL/6J and B6CBA mouse strains, and specifically to our R6/1 mouse model. Retro-orbital injection in A2a Cre mice resulted in region-specific transduction of the virus, demonstrating its potential to target specific circuits. Nevertheless, GFP fluorescence was not observed in any of the cases after intranasal administration. These results highlight retro-orbital injection as a minimally invasive approach for efficiently targeting brain regions across various cell types and mouse strains, offering an alternative to stereotaxic surgery. However, additional research on viral capsid modifications is required to facilitate neural cell infection through intranasal administration.

To continue with our objective, we next characterised the cell-type-specific DdPAC stimulation effects in the brain. Accordingly, we first aimed to investigate if DdPAC-mediated cAMP modulation was able to enhance synaptic plasticity. Therefore, we injected DdPAC under the CamKIIa or GFAP promoters into the cortex to selectively express it in neurons and astrocytes, followed by multi-electrode array recordings. Red-light illumination enhanced neuronal potentiation in both neuronal and astrocytic-driven DdPAC activation, though the effect was more pronounced when DdPAC was activated in astrocytes. Thus, the following experiments of this objective were focused on investigating DdPAC activation in cortical astrocytes. Thereby, we further characterised the mechanism underlying this potentiation, demonstrating that DdPAC-mediated cAMP increase is PKA- and NMDAR-dependent, but calcium-independent, requires synaptic activity, and induces glutamate gliotransmission. To gain deeper insights into the in vivo effects of astrocytic DdPAC activation, we performed phospho-proteomics and proteomics analyses. Our omics data validated the involvement of the cAMP-PKA signalling pathway in astrocytic DdPAC-mediated effects, further supported its main role in synaptic plasticity, while also revealing a broad brain effect of astrocytic activation.

Collectively, the data from the second objective position DdPAC as a powerful tool for modulating synaptic plasticity in the brain through targeted manipulation of the cAMP-PKA pathway in astrocytes, while also establishing a robust, minimally invasive method for its in vivo application.

Finally, we pursued our third objective of restoring physiological function through light-driven DdPAC stimulation in mouse models of HD and AD. We began by investigating the functional effects of astrocytic DdPAC activation in the two most affected regions in HD, the cortex and striatum. To this end, DdPAC was injected into cortical or striatal astrocytes of the R6/1 mouse model to assess its ability to modulate brain function. First, in cortical DdPAC stimulation experiments, we examined hemodynamic changes using a light scattering imaging technique, followed by an evaluation of motor-related behaviour. Hemodynamic analysis revealed cortical overactivation following acute DdPAC activation in cortical astrocytes of R6/1 mice, a response not observed in wild-type (WT) mice. Moreover, repeated DdPAC stimulation in cortical astrocytes impaired coordination in R6/1 mice, as indicated by the vertical pole test, while enhancing motor learning in WT mice, assessed by the ARR. Notably, post-mortem analysis revealed increased GFAP expression only in WT mice after repeated stimulation and behavioural assessments. Next, we examined motor-related behaviour following DdPAC stimulation in striatal astrocytes. In this case, astrocytic DdPAC-mediated cAMP modulation impaired coordination in both WT and R6/1 mice, while sparing motor learning. Additionally, GFAP expression was elevated in both WT and R6/1 mice. Taken together, these results suggest that astrocytic DdPAC modulation varies depending on the brain region and molecular context, leading to distinct outcomes in the cortex and striatum of WT and R6/1 mice. Moreover, our data suggest that increased cAMP levels in astrocytes are detrimental in HD; therefore, strategies aimed at specifically reducing astrocytic cAMP may offer greater therapeutic potential for the disease.

In parallel, we investigated the effects of DdPAC-mediated cAMP signalling in neurons and astrocytes of the hippocampus, the most affected region in AD. For this purpose, we injected DdPAC into hippocampal neurons and astrocytes from WT and 5xFAD mice, followed by histological and proteomic analyses. Notably, histological analyses revealed a reduction in GFAP expression and amyloid-β deposits in the hippocampus where DdPAC was activated in astrocytes, but not where DdPAC was activated in neurons. Proteomic analysis of DdPAC-activated astrocytes revealed a response primarily associated with glial activation and immune processes, as well as synaptic plasticity, whereas neuronal activation predominantly influenced synaptic plasticity. In both cases, cytoskeletal regulation emerged as a key function, though the implicated proteins differed between neurons and astrocytes. Additionally, the effects of DdPAC activation in either neurons or astrocytes varied between WT and 5xFAD mice, indicating a differential effect dependent on the molecular context. These findings further support the notion that the effects of DdPAC modulation are dependent on brain region, molecular context, and cell type specificity.

In summary, this thesis provides new insights into the cAMP pathway in synaptic plasticity and neurodegenerative disorders. First, our data demonstrates the involvement of neuronal cAMP in M2 cortical behaviours and reveal altered neuronal cAMP dynamics in HD mice. Additionally, we identify early motor and psychiatric M2-cortex-related impairments, highlighting the potential for early therapeutic interventions. To facilitate in vivo application, we establish a minimally invasive method for AAV delivery that successfully achieves transgene expression in specific cell types and mouse strains. Notably, we uncover the capacity of DdPAC-mediated cAMP signalling modulation to enhance synaptic plasticity in the cortex, particularly when activated in astrocytes. In the context of neurodegeneration, DdPAC activation in HD and AD models produces differential effects: in HD, cortical astrocyte activation improves motor learning in WT but impairs coordination in HD mice, while striatal astrocyte activation disrupts coordination in both. In AD, increasing cAMP in hippocampal astrocytes reduces astrogliosis and Aβ deposits, whereas neuronal activation decreases microglial reactivity. Proteomic analysis of hippocampal samples reveals distinct DdPAC-driven proteomic changes in neurons and astrocytes, as well as between WT and AD mice, linking cAMP-PKA pathway activation to synaptic plasticity and immune responses.

In conclusion, this thesis reveals new roles for cAMP signalling and propose it as a promising therapeutic target for neurodegenerative diseases. Our results show that DdPAC-mediated modulation of cAMP in both neurons and astrocytes profoundly affects neuronal plasticity, with astrocytic cAMP-PKA modulation producing more widespread effects. Additionally, our findings highlight the importance of brain region and molecular context in shaping the outcomes of cAMP modulation, as DdPAC activation produces distinct effects in the cortex, striatum, and hippocampus, which vary depending on the disease state. Ultimately, we provide strong evidence for DdPAC as a versatile tool to modulate cAMP-PKA signalling, with potential applications in neuroscience research and therapeutic development.

[cat] Amb l’envelliment de la població, les malalties neurodegeneratives representen un problema creixent de salut pública, que podria derivar en una càrrega social i econòmica insostenible si les tendències actuals persisteixen. Sorprenentment, la majoria d’aquestes malalties no tenen cura i ni tan sols un tractament efectiu que millori la qualitat de vida de les persones afectades. Una característica distintiva dels trastorns neurodegeneratius és la disfunció sinàptica, que apareix tot i l’absència de pèrdua neuronal, i està provocada per l’acumulació de proteïnes mal plegades, la qual cosa condueix a alteracions moleculars, de circuits i funcionals (Palop 2006). No obstant això, els mecanismes exactes que provoquen aquestes alteracions específiques encara no es comprenen del tot. Això posa de manifest la necessitat d’aprofundir en la comprensió d’aquestes malalties i, encara més important, la necessitat urgent de desenvolupar noves estratègies terapèutiques, potencialment basades en la modulació de la plasticitat cerebral. En aquesta tesi, ens hem centrat en dues malalties neurodegeneratives: la malaltia de Huntington (MH) i la malaltia d’Alzheimer (MA). La MH és un trastorn neurodegeneratiu genètic autosòmic dominant, caracteritzat per una degeneració progressiva de les regions estriatals i corticals del cervell (Huntington, 2003; Walker, 2007). La malaltia es manifesta amb dèficits motors com la corea, la distonia i la descoordinació, així com amb deteriorament cognitiu i alteracions psiquiàtriques. La MH està causada per una mutació en el gen de la huntingtina (HTT), amb una repetició expandida del triplet CAG que dona lloc a una forma mutada de la proteïna huntingtina (mHTT), la qual condueix a la neurodegeneració (The Huntington’s Disease Collaborative Research Group, 1993a). La MH es caracteritza per una pèrdua neuronal selectiva i una plasticitat sinàptica deteriorada, especialment en l’escorça cerebral i l’estriat, on les neurones espinoses mitjanes són especialment vulnerables (Vonsattel & DiFiglia, 1998). La disrupció de la via escorça-estriat, que té un paper fonamental en les funcions motores i cognitives, contribueix als símptomes de la malaltia (Cepeda et al., 2007). L’MA, per la seva banda, és la causa principal de demència i es caracteritza per un deteriorament progressiu de la memòria, així com per alteracions del llenguatge, la funció executiva i les habilitats visuoespacials (Scheltens et al., 2021; Stelzmann et al., 1995). L’MA es classifica en familiar, causada per mutacions en gens com APP, PSEN1 i PSEN2, amb un inici precoç que representa menys del 0,5% dels casos, i MA esporàdica, que representa el 99,5% dels casos i està influïda per factors genètics, ambientals i d’estil de vida (Bateman et al., 2011; Bertram et al., 2010). L’MA es caracteritza per la presència de plaques amiloides, cabdells neurofibril·lars i neuroinflamació. La disfunció sinàptica, especialment a l’hipocamp, es correlaciona de manera directe amb el deteriorament cognitiu observat en l’MA (Querfurth & LaFerla, 2010). Per tant, la plasticitat sinàptica constitueix una alteració primerenca en ambdues malalties, fet que destaca la necessitat de desenvolupar estratègies terapèutiques que específicament es focalitzin en aquests canvis inicials. La plasticitat sinàptica és el mecanisme mitjançant el qual les connexions sinàptiques al cervell s’enforteixen o s’afebleixen en resposta a diversos estímuls. Les alteracions en aquest procés constitueixen una de les principals característiques de la MH i la MA, contribuint de manera significativa als dèficits funcionals observats en aquestes patologies (J. Y. Li et al., 2003; Selkoe, 2002). En la plasticitat sinàptica a llarg termini, l’activació dels receptors per neurotransmissors desencadena vies de senyalització que afavoreixen l’enfortiment sinàptic, sovint associades a l’entrada de calci. Un component clau d’aquest enfortiment és la inserció de nous receptors a la membrana postsinàptica, un procés que requereix l’activitat de proteïnes quinases i la síntesi local de proteïnes. Més enllà del calci, una altra molècula de senyalització fonamental pel manteniment de la plasticitat és el monofosfat d’adenosina cíclic (AMPc). L’AMPc és modulat per l’activitat de receptors metabotròpics i, entre múltiples dianes, activa la proteïna quinasa A (PKA), la qual fosforila factors de transcripció com CREB, iniciant així l’expressió gènica necessària per a les modificacions sinàptiques a llarg termini (Benito & Barco, 2010). A més, la via de senyalització AMPc-PKA és essencial per establir canvis estructurals a les sinapsis, i la seva activació s’ha associat amb una plasticitat sinàptica enfortida en diverses regions cerebrals (C. C. Huang & Hsu, 2006; Nguyen & Kandel, 1997). Paral·lelament, els astròcits també contribueixen a la plasticitat sinàptica. No obstant això, els mecanismes pels quals l’AMPc participa en la plasticitat sinàptica encara no s’han comprès del tot, ni tampoc el seu paper específic en neurones o astròcits. De fet, les alteracions en la senyalització de l’AMPc estan sent cada vegada més relacionades amb l’envelliment i amb malalties neurodegeneratives com MH i MH (Kelly, 2018). Tant la via escorça-estriat en MH com l’hipocamp en MH mostren disrupcions en la via de senyalització AMPc-PKA. En el cas de la MH, s’ha descrit una disminució de la senyalització de l’AMPc en l’escorça i l’estriat, i un augment a l’hipocamp, tot i que aquests resultats continuen sent controvertits. En canvi, en la MH està més ben establert que la senyalització d’AMPc disminueix a l’hipocamp, contribuint de manera clau al desenvolupament de la patologia associada a la demència. Davant les controvèrsies sobre el paper d’AMPc en MH, i considerant la gran importància de l’escorça en aquesta malaltia, el nostre primer objectiu és caracteritzar les alteracions en la senyalització d’AMPc i el comportament associat amb l’escorça del model murí R6/1 per a la malaltia. Per tant, estratègies dirigides a potenciar la plasticitat sinàptica mitjançant la modulació de la senyalització de l’AMPc podrien tenir un gran potencial per mitigar o retardar la disfunció de xarxes neuronals associada a trastorns neurodegeneratius com la MH i la MA. En aquest sentit, les eines optogenètiques permeten un control precís de mecanismes biològics mitjançant proteïnes sensibles a la llum. Particularment, les adenilat ciclases fotoactivades (PACs) són enzims que augmenten els nivells d’AMPc en resposta a la llum, mitjançant un domini d’adenilat ciclasa acoblat a un mòdul fotorreceptor (Iseki & Park, 2021). Entre aquestes, la DdPAC és una PAC recentment optimitzada que regula els nivells d’AMPc en resposta a llum vermella (Stüven et al., 2018). Desenvolupada inicialment en bacteris, la DdPAC ha demostrat una resposta a la llum més potent en comparació amb altres PACs sensibles a la llum vermella. No obstant això, la seva aplicació en cèl·lules cerebrals i in vivo encara no ha estat explorada. Considerant la capacitat de la llum vermella per penetrar en els teixits amb una dispersió mínima, DdPAC representa una eina prometedora per a aplicacions no invasives. Per tant, el nostre segon objectiu és establir l’ús de DdPAC com a eina optogenètica per modular la plasticitat sinàptica in vivo, de manera no invasiva. D’altra banda, donada la vulnerabilitat regional i les diferències patofisiològiques observades entre MH i la AD, que poden afectar a la modulació d’AMPc i plasticitat sinàptica, el nostre tercer objectiu és restaurar la funció fisiològica mitjançant l’estimulació lumínica de DdPAC en models murins de totes dues malalties. En aquest cas, l’atenció se centrarà en les regions més afectades en cada patologia: l’estriat i l’escorça en el cas de la MH, i l’hipocamp en la MA. Tenint en compte aquesta informació, l'objectiu principal d'aquesta tesi és restaurar la funció fisiològica en malalties neurodegeneratives mitjançant la modulació de la plasticitat cerebral a través de l'activació lumínica de la senyalització d’AMPc, mediada per DdPAC, en circuits cerebrals específics Per assolir el nostre primer objectiu i caracteritzar les alteracions en la senyalització d’AMPc i el comportament relacionat amb l’escorça en el model murí R6/1 de la malaltia de Huntington, primer vam avaluar les alteracions d’AMPc en l’escorça durant tasques de comportament relacionades amb la via escorça-estriat en ratolins R6/1. Per investigar la dinàmica d’AMPc, vam realitzar enregistraments de fibre photometry utilitzant el sensor GFlamp-1, un nou sensor d’AMPc, en neurones de l’escorça M2 de ratolins mascles i femelles WT i R6/1 de 14 i 20 setmanes d’edat, durant les tasques de beetle-mania (BMT) i rotarod accelerant (ARR). Primer vam avaluar la dinàmica d’AMPc durant la BMT, observant un increment dels nivells d’AMPc tant en els ratolins WT com en els R6/1 després de la introducció de l’escarabat. Malgrat que els ratolins R6/1 ja mostraven un comportament alterat durant el test, no es van detectar diferències en els nivells d’AMPc entre els genotips. Aquestes dades revelen la implicació de la senyalització neuronal d’AMPc durant la BMT, amb alteracions mínimes en els ratolins R6/1. Posteriorment, per entendre millor la contribució d’AMPc en tasques relacionades amb l’escorça M2, vam explorar la dinàmica d’AMPc durant l’ARR. Els nostres resultats estaven en línia amb els observats durant la BMT, ja que els nivells d’AMPc neuronal tant en ratolins WT com R6/1 augmentaven amb l’inici de la tasca. A diferència dels resultats obtinguts amb la BMT, en aquest cas vam observar una sobre-activació aberrant de l’escorça M2 en els ratolins R6/1. Finalment, per esbrinar si les alteracions en l’activitat d’AMPc durant tasques relacionades amb M2 són més evidents en etapes més avançades de la malaltia, vam repetir la BMT en la mateixa cohort de ratolins a les 20 setmanes, quan els animals són plenament simptomàtics. A aquesta edat, encara vam poder observar un augment d’AMPc neuronal en WT i R6/1 després de la introducció de l’escarabat. No obstant això, aquest increment fou significativament menor en els ratolins R6/1. En conjunt, aquests resultats destaquen la implicació d’AMPc neuronal en tasques relacionades amb l’escorça M2 i mostren alteracions en el context de la MH. Atesa la importància crítica de l’escorça M2 en la fisiopatologia de la MH, també vam voler determinar si sorgeixen símptomes addicionals associats a la disfunció escorça-estriat en les primeres etapes de la malaltia en el model R6/1. Per fer-ho, vam seleccionar dues proves conductuals, el adhesive removal test i el marble-burying test, ambdues relacionades amb l’escorça M2 i la via escorça-estriat, i les vam dur a terme longitudinalment des de les 4 fins a les 16 setmanes d’edat. En el adhesive removal test, relacionat amb la via escorça M2–escorça somatosensorial–estriat, vam observar dèficits motors des de les 8 setmanes, mentre que els dèficits somatosensorials van aparèixer a les 16 setmanes. En el marble-burying test, relacionat amb la via escorça M2–escorça orbitofrontal–estriat, vam observar un comportament similar a l’anhedònia des de les 8 setmanes. Aquestes dades indiquen que la disfunció de la via escorça-estriat sorgeix en estadis molt primerencs, remarcant el potencial de les intervencions terapèutiques precoces. Globalment, els resultats d’aquest primer objectiu indiquen que la disfunció de la via escorça-estriat relacionada amb l’escorça M2 emergeix en estadis inicials de la malaltia, destacant el potencial de les intervencions terapèutiques en fases primerenques. Atès que la senyalització d’AMPc neuronal es manté funcional en ratolins amb comportament alterat, és poc probable que sigui la responsable directa dels dèficits conductuals relacionats amb M2, suggerint que altres mecanismes podrien estar involucrats. Per assolir el segon objectiu i implementar la DdPAC com a nova eina optogenètica per modular la plasticitat sinàptica de manera no invasiva a través de la senyalització d’AMPc, primer vam voler establir un mètode mínimament invasiu per a la seva administració al cervell a través de vectors AAV. Per això, vam dissenyar constructes vírics amb GFP sota tres promotors diferents (CAG, CamKIIa i FLEXon), i les vam administrar utilitzant dos serotips d’AAV (AAV9 i PHP.eB), en dues soques de ratolins diferents (C57BL/6J i B6CBA), i mitjançant tres vies d’administració, de més a menys invasiva (intra-cranial, retro-orbital i intra-nasal). En resum, l’expressió de GFP es va detectar en diverses regions cerebrals i en tipus cel·lulars específics després de la injecció retro-orbital dels vectors PHP.eB i AAV9, mostrant el serotip PHP.eB una infecció més àmplia. A més, vam aconseguir expressar els constructes vírics de PHP.eB en dues soques murines i específicament en el nostre model R6/1. A més, la injecció retro-orbital en ratolins A2a-Cre va resultar en una transducció regional específica, demostrant el seu potencial per dirigir circuits específics. Tanmateix, no es va observar fluorescència de GFP després de l’administració intra-nasal en cap dels casos. Aquests resultats posen de manifest la injecció retro-orbital com una via mínimament invasiva per arribar a regions cerebrals de manera eficient i en diferents tipus cel·lulars i soques de ratolins, oferint una alternativa a la cirurgia estereotàxica. No obstant això, cal recerca addicional sobre la modificació de càpsides virals per facilitar la infecció de cèl·lules neurals via administració intra-nasal. Per continuar amb aquest objectiu, vam caracteritzar els efectes de l’activació de DdPAC en tipus cel·lulars específics del cervell. En primer lloc, vam investigar si la modulació de AMPc mitjançant DdPAC era capaç d’afavorir la plasticitat sinàptica. Per això, vam injectar DdPAC sota els promotors CamKIIa o GFAP a l’escorça per expressar-la selectivament en neurones i astròcits, respectivament, i posteriorment vam realitzar enregistraments amb matrius d’electrodes múltiples (MEAs). La il·luminació amb llum vermella va aconseguir potenciar l’activitat neuronal tant en l’activació neuronal com astroglial de la DdPAC, tot i que l’efecte va ser més pronunciat quan aquesta s’activava en astròcits. Per aquest motiu, els experiments següents d’aquest objectiu es van centrar en investigar l’activació de DdPAC en astròcits corticals. Així, vam caracteritzar el mecanisme subjacent d’aquesta potenciació, demostrant que l’augment d’AMPc induït per DdPAC és dependent de PKA i NMDAR, però independent del calci, requereix activitat sinàptica, i indueix gliotransmissió de glutamat. Per aprofundir en els efectes in vivo de l’activació astroglial de la DdPAC, vam realitzar anàlisis de fosfoproteòmica i proteòmica. Les dades òmiques van validar la implicació de la via AMPc-PKA en els efectes astroglials de la DdPAC, recolzant el seu paper central en la plasticitat sinàptica, alhora que revelant un efecte cerebral ampli derivat de l’activació dels astròcits. En conjunt, les dades del segon objectiu posicionen la DdPAC com una eina potent per modular la plasticitat sinàptica al cervell mitjançant la manipulació dirigida de la via AMPc-PKA en astròcits, alhora que estableixen un mètode robust i mínimament invasiu per a la seva aplicació in vivo. Finalment, vam abordar el nostre tercer objectiu: restaurar la funció fisiològica mitjançant l’estimulació lumínica de DdPAC en models murins de la MH i la MA. En primer lloc, vam investigar els efectes funcionals de l’activació astrocítica de DdPAC en dues de les regions més afectades en la MH: l’escorça cerebral i l’estriat. Per a això, vam injectar DdPAC en astròcits corticals o estriatals del model murí R6/1 per avaluar la seva capacitat de modular la funció cerebral. En els experiments d’estimulació cortical, es van analitzar els canvis hemodinàmics mitjançant una tècnica d’imatge basada en dispersió de llum i, posteriorment, es va avaluar el comportament motor. L’anàlisi hemodinàmica va revelar una sobre-activació de l’escorça després de l’activació aguda de DdPAC en astròcits de l’escorça dels ratolins R6/1, una resposta que no es va observar en ratolins control. A més, l’estimulació repetida de DdPAC en astròcits de l’escorça va deteriorar la coordinació en ratolins R6/1, tal com es va evidenciar en el test del pal vertical (vertical pole), mentre que va millorar l’aprenentatge motor en ratolins WT, avaluat mitjançant el test de rotarrod accelerat. A més, l’anàlisi post-mortem va revelar un augment en l’expressió de GFAP només en ratolins WT després de l’estimulació repetida i les proves conductuals. Tot seguit, vam examinar el comportament motor després de l’estimulació de DdPAC en astròcits estriatals. En aquest cas, la modulació d’AMPc mitjançant DdPAC en astròcits va deteriorar la coordinació tant en ratolins WT com R6/1, mentre que l’aprenentatge motor es va mantenir preservat. A més, l’expressió de GFAP va augmentar en ambdós grups. En conjunt, aquests resultats suggereixen que la modulació astrocítica de DdPAC produeix efectes diferenciats segons la regió cerebral i el context molecular, amb resultats diversos a l’escorça i a l’estriat en ratolins WT i R6/1. A més, les nostres dades suggereixen que l’augment dels nivells d’AMPc en astròcits pot ser perjudicial en el context de la HD, de manera que estratègies dirigides a reduir específicament l’AMPc astrocític podrien tenir més potencial terapèutic. En paral·lel, vam investigar els efectes de la senyalització d’AMPc mitjançant DdPAC en neurones i astròcits de l’hipocamp, la regió més afectada en la MA. Per a això, vam injectar DdPAC en neurones i astròcits de l’hipocamp de ratolins WT i 5xFAD, seguit d’anàlisis histològiques i proteòmiques. Notablement, les anàlisis histològiques van revelar una reducció en l’expressió de GFAP i en els dipòsits d’amiloide-β a l’hipocamp on s’havia activat DdPAC en astròcits, però no en les regions amb activació neuronal. L’anàlisi proteòmica d’astròcits activats per DdPAC va revelar una resposta principalment associada a processos d’activació glial i resposta immunitària, així com a plasticitat sinàptica, mentre que l’activació neuronal va influenciar majoritàriament la plasticitat sinàptica. En ambdós casos, la regulació del citoesquelet va emergir com una funció clau, tot i que les proteïnes implicades diferien entre neurones i astròcits. A més, els efectes de l’activació de DdPAC, tant en neurones com en astròcits, van variar entre ratolins WT i 5xFAD, indicant un efecte diferencial depenent del context molecular. Aquests resultats reforcen la idea que els efectes de la modulació mitjançant DdPAC depenen de la regió cerebral, del context molecular i de l’especificitat cel·lular. En resum, aquesta tesi aporta nous coneixements sobre la via d’AMPc en la plasticitat sinàptica i les malalties neurodegeneratives. En primer lloc, les nostres dades demostren la participació d’AMPc neuronal en comportaments relacionats amb l’escorça M2 i revelen alteracions en la dinàmica d’AMPc neuronal en ratolins amb HD. A més, identifiquem dèficits motors i psiquiàtrics precoços associats a l’escorça M2, posant en relleu el potencial per a intervencions terapèutiques en fases inicials. Per facilitar l’aplicació de teràpies en el cervell, establim un mètode mínimament invasiu per a l’administració d’AAV que permet una expressió eficaç del transgen en tipus cel·lulars i soques murines específiques. Notablement, hem demostrat la capacitat de la modulació d’AMPc mitjançant DdPAC per potenciar la plasticitat sinàptica en escorça, especialment quan s’activa en astròcits. En el context de la neurodegeneració, l’activació de DdPAC en models de la MH i MA produeix efectes diferencials: en la MH, l’activació d’astròcits corticals millora l’aprenentatge motor en ratolins WT però deteriora la coordinació en ratolins amb MH, mentre que l’activació d’astròcits estriatals afecta negativament la coordinació en ambdós. En la MA, l’augment d’AMPc en astròcits de l’hipocamp redueix l’astrogliosi i els dipòsits d’amiloide-β, mentre que l’activació neuronal redueix la reactivitat microglial. L’anàlisi proteòmica de mostres hipocampals revela canvis diferencials induïts per DdPAC en neurones i astròcits, així com entre ratolins WT i AD, vinculant l’activació de la via AMPc-PKA a la plasticitat sinàptica i les respostes immunitàries. En conclusió, aquesta tesi revela noves funcions de la senyalització d’AMPc i la proposa com una diana terapèutica prometedora en malalties neurodegeneratives. Els nostres resultats demostren que la modulació d’AMPc mitjançant DdPAC en neurones i astròcits té un impacte profund en la plasticitat neuronal, sent la modulació d’AMPc-PKA en astròcits la que produeix efectes més amplis. A més, destaquem la importància de la regió cerebral i del context molecular en els resultats de la modulació d’AMPc, ja que l’activació de DdPAC produeix efectes diferenciats a l’escorça, estriat i hipocamp, i segons l’estat patològic. En última instància, aportem una evidència sòlida que posiciona DdPAC com una eina versàtil per modular la senyalització d’AMPc-PKA, amb aplicacions potencials tant en recerca en neurociència com en desenvolupament terapèutic.