Illuminating cAMP signalling in neurodegenerative diseases: from synaptic plasticity mechanisms to therapeutic opportunities

Abstract

[eng] With the ageing of the population, neurodegenerative diseases represent a growing public health problem, which could lead to an unsustainable social and economic burden if current trends persist. Surprisingly, most of these diseases have no cure and not even an effective treatment that improves the quality of life of those affected. A distinctive feature of neurodegenerative disorders is synaptic dysfunction, which appears despite the absence of neuronal loss, and is caused by the accumulation of misfolded proteins, which leads to molecular, circuit, and functional alterations (Palop 2006). However, the exact mechanisms that cause these specific alterations are not yet fully understood. This highlights the need to deepen the understanding of these diseases and, even more importantly, the urgent need to develop new therapeutic strategies, potentially based on the modulation of brain plasticity. In this thesis, we have focused on two neurodegenerative diseases: Huntington's disease (HD) and Alzheimer's disease (AD). HD is an autosomal dominant genetic neurodegenerative disorder, characterized by progressive degeneration of the striatal and cortical regions of the brain (Huntington, 2003; Walker, 2007). The disease manifests itself with motor deficits such as chorea, dystonia and lack of coordination, as well as cognitive impairment and psychiatric disorders. HD is caused by a mutation in the huntingtin gene (HTT), with an expanded repetition of the CAG triplet resulting in a mutated form of the huntingtin protein (mHTT), which leads to neurodegeneration (The Huntington's Disease Collaborative Research Group, 1993a). HD is characterized by selective neuronal loss and impaired synaptic plasticity, especially in the cerebral cortex and striatum, where the middle spinous neurons are especially vulnerable (Vonsattel & DiFiglia, 1998). Disruption of the cortex-striatum pathway, which plays a fundamental role in motor and cognitive functions, contributes to the symptoms of the disease (Cepeda et al., 2007). AD, on the other hand, is the main cause of dementia and is characterized by progressive memory impairment, as well as alterations in language, executive function, and visuospatial skills (Scheltens et al., 2021; Stelzmann et al., 1995). AD is classified as familial, caused by mutations in genes such as APP, PSEN1 and PSEN2, with an early onset that accounts for less than 0.5% of cases, and sporadic AD, which accounts for 99.5% of cases and is influenced by genetic, environmental, and lifestyle factors (Bateman et al., 2011; Bertram et al., 2010). AD is characterized by the presence of amyloid plaques, neurofibrillary buds, and neuroinflammation. Synaptic dysfunction, especially in the hippocampus, is directly correlated with the cognitive impairment observed in AD (Querfurth & LaFerla, 2010). Therefore, synaptic plasticity constitutes an early alteration in both diseases, which highlights the need to develop therapeutic strategies that specifically focus on these initial changes. Synaptic plasticity is the mechanism by which synaptic connections in the brain are strengthened or weakened in response to various stimuli. Alterations in this process constitute one of the main characteristics of HD and AD, contributing significantly to the functional deficits observed in these pathologies (J. Y. Li et al., 2003; Selkoe, 2002). In long-term synaptic plasticity, the activation of receptors by neurotransmitters triggers signaling pathways that favor synaptic strengthening, often associated with calcium input. A key component of this strengthening is the insertion of new receptors into the postsynaptic membrane, a process that requires the activity of protein kinases and local protein synthesis. Beyond calcium, another signaling molecule that is fundamental for maintaining plasticity is cyclic adenosine monophosphate (cAMP). cAMP is modulated by the activity of metabotropic receptors and, among multiple targets, activates protein kinase A (PKA), which phosphorylates transcription factors such as CREB, thus initiating the gene expression necessary for long-term synaptic modifications (Benito & Barco, 2010). In addition, the cAMP-PKA signaling pathway is essential for establishing structural changes at synapses, and its activation has been associated with enhanced synaptic plasticity in several brain regions (C. C. Huang & Hsu, 2006; Nguyen & Kandel, 1997). At the same time, astrocytes also contribute to synaptic plasticity. However, the mechanisms by which cAMP participates in synaptic plasticity have not yet been fully understood, nor their specific role in neurons or astrocytes. In fact, alterations in cAMP signaling are increasingly related to aging and neurodegenerative diseases such as HD and HD (Kelly, 2018). Both the cortex-striatum pathway in HD and the hippocampus in HD show disruptions in the cAMP-PKA signaling pathway. In the case of HD, a decrease in cAMP signaling in the cortex and striatum, and an increase in the hippocampus, have been described, although these results remain controversial. On the other hand, in HD it is better established that cAMP signaling decreases in the hippocampus, contributing in a key way to the development of the pathology associated with dementia. In view of the controversies about the role of cAMP in HD, and considering the great importance of the cortex in this disease, our first objective is to characterize the alterations in cAMP signaling and the behavior associated with the cortex of the R6/1 mouse model for the disease. Therefore, strategies aimed at enhancing synaptic plasticity by modulating cAMP signaling could have great potential to mitigate or delay neural network dysfunction associated with neurodegenerative disorders such as HD and AD. In this sense, optogenetic tools allow precise control of biological mechanisms using light-sensitive proteins. In particular, photoactivated adenylate cyclades (PACs) are enzymes that increase cAMP levels in response to light, through an adenylate cyclase domain coupled to a photoreceptor module (Iseki & Park, 2021). Among these, DdPAC is a newly optimized CAP that regulates cAMP levels in response to red light (Stüven et al., 2018). Initially developed in bacteria, DdPAC has demonstrated a more potent light response compared to other red light-sensitive PACs. However, its application in brain cells and in vivo has not yet been explored. Considering the ability of red light to penetrate tissues with minimal dispersion, DdPAC represents a promising tool for non-invasive applications. Therefore, our second objective is to establish the use of DdPAC as an optogenetic tool to modulate synaptic plasticity in vivo, in a non-invasive way. On the other hand, given the regional vulnerability and pathophysiological differences observed between HD and AD, which can affect cAMP modulation and synaptic plasticity, our third objective is to restore physiological function through light stimulation of DdPAC in mouse models of both diseases. In this case, attention will be focused on the regions most affected by each pathology: the striatum and cortex in the case of HD, and the hippocampus in AD. Taking this information into account, the main objective of this thesis is to restore physiological function in neurodegenerative diseases by modulating brain plasticity through light activation of cAMP signaling, mediated by DdPAC, in specific brain circuits To achieve our first objective and characterize alterations in cAMP signaling and cortex-related behavior in the R6/1 mouse model of Huntington's disease, we first evaluated cAMP alterations in the cortex during behavioral tasks related to the cortex-striatum pathway in R6/1 mice. To investigate the dynamics of cAMP, we performed fibre photometry recordings using the GFlamp-1 sensor, a novel cAMP sensor, on neurons in the M2 cortex of 14- and 20-week-old WT and female WT and R6/1 mice, during beetle-mania (BMT) and rotarod accelerator (ARR) tasks. We first evaluated the dynamics of cAMP during BMT, observing an increase in cAMP levels in both WT and R6/1 mice after beetle introduction. Although the R6/1 mice already showed altered behaviour during the test, no differences in cAMP levels were detected between the genotypes. These data reveal the involvement of neuronal cAMP signaling during BMT, with minimal alterations in R6/1 mice. Subsequently, to better understand the contribution of cAMP in tasks related to the M2 cortex, we explored the dynamics of cAMP during ARR. Our results were in line with those observed during BMT, as neuronal cAMP levels in both WT and R6/1 mice increased with the onset of the task. Unlike the results obtained with BMT, in this case we observed an aberrant over-activation of the M2 cortex in R6/1 mice. Finally, to find out if alterations in cAMP activity during M2-related tasks are more evident in more advanced stages of the disease, we repeated BMT in the same cohort of mice at 20 weeks, when the animals are fully symptomatic. At this age, we could still observe an increase in neuronal cAMP in WT and R6/1 after the introduction of the beetle. However, this increase was significantly smaller in R6/1 mice. Overall, these results highlight the involvement of neuronal cAMP in tasks related to the M2 cortex and show alterations in the context of HD. Given the critical importance of the M2 cortex in the pathophysiology of HD, we also wanted to determine whether additional symptoms associated with cortex-striatum dysfunction arise in the early stages of the disease in the R6/1 model. To do this, we selected two behavioral tests, the adhesive removal test and the marble-burying test, both related to the M2 cortex and the cortex-striated pathway, and carried them out longitudinally from 4 to 16 weeks of age. In the adhesive removal test, related to the M2–somatosensory cortex–striatum pathway, we observed motor deficits from 8 weeks, while somatosensory deficits appeared at 16 weeks. In the marble-burying test, related to the M2–orbitofrontal–striated cortex pathway, we observed a similar behaviour to anhedonia from 8 weeks onwards. These data indicate that the dysfunction of the cortex-striatum pathway arises in very early stages, highlighting the potential of early therapeutic interventions. Overall, the results of this first objective indicate that crust-striatum pathway dysfunction related to the M2 cortex emerges in the early stages of the disease, highlighting the potential of therapeutic interventions in early stages. Since neuronal cAMP signaling remains functional in mice with altered behavior, it is unlikely to be directly responsible for M2-related behavioral deficits, suggesting that other mechanisms could be involved. To achieve the second objective and implement DdPAC as a new optogenetic tool to modulate synaptic plasticity in a non-invasive way through cAMP signaling, we first wanted to establish a minimally invasive method for its administration to the brain through AAV vectors. For this reason, we designed viral constructs with GFP under three different promoters (CAG, CamKIIa and FLEXon), and administered them using two AAV serotypes (AAV9 and PHP.eB), in two different mouse strains (C57BL/6J and B6CBA), and through three routes of administration, from more to less invasive (intra-cranial, retro-orbital and intra-nasal). In summary, GFP expression was detected in several brain regions and in specific cell types after retro-orbital injection of the PHP.eB and AAV9 vectors, showing the PHP.eB serotype a wider infection. In addition, we managed to express the viral constructs of PHP.eB in two murine strains and specifically in our R6/1 model. In addition, retro-orbital injection into A2a-Cre mice resulted in specific regional transduction, demonstrating its potential to direct specific circuits. However, no GFP fluorescence was observed after intra-nasal administration in any of the cases. These results highlight retro-orbital injection as a minimally invasive pathway to reach brain regions efficiently and in different cell types and mouse strains, offering an alternative to stereotactic surgery. However, further research is needed on viral capsid modification to facilitate neural cell infection via intranasal administration. To continue with this objective, we characterized the effects of DdPAC activation on specific cell types in the brain. First, we investigated whether cAMP modulation by DdPAC was able to promote synaptic plasticity. Therefore, we injected DdPAC under the CamKIIa or GFAP promoters into the cortex to selectively express it in neurons and astrocytes, respectively, and subsequently made recordings with multiple electrode arrays (MEAs). Red light illumination succeeded in enhancing neuronal activity in both neuronal and astroglial activation of DdPAC, although the effect was more pronounced when it was activated in astrocytes. For this reason, subsequent experiments with this objective focused on investigating the activation of DdPAC in cortical astrocytes. Thus, we characterized the underlying mechanism of this potentiation, demonstrating that the DdPAC-induced cAMP increase is PKA and NMDAR dependent, but calcium-independent, requires synaptic activity, and induces glutamate gliotransmission. To delve into the in vivo effects of astroglial activation of DdPAC, we performed phosphoproteomics and proteomics analyses. The omics data validated the involvement of the cAMP-PKA pathway in the astroglial effects of DdPAC, supporting its central role in synaptic plasticity, while revealing a broad brain effect derived from astrocyte activation. Overall, the data from the second objective position DdPAC as a powerful tool to modulate synaptic plasticity in the brain through targeted manipulation of the cAMP-PKA pathway in astrocytes, while establishing a robust and minimally invasive method for its application in vivo. Finally, we addressed our third objective: to restore physiological function through light stimulation of DdPAC in mouse models of HD and AD. First, we investigated the functional effects of astrocytic activation of DdPAC in two of the most affected regions in HD: the cerebral cortex and striatum. To do this, we injected DdPAC into cortical or striatal astrocytes of the R6/1 mouse model to evaluate their ability to modulate brain function. In cortical stimulation experiments, hemodynamic changes were analyzed using an imaging technique based on light scattering and, subsequently, motor behavior was evaluated. Hemodynamic analysis revealed an over-activation of the cortex after acute activation of DdPAC in astrocytes in the cortex of R6/1 mice, a response that was not observed in control mice. In addition, repeated stimulation of DdPAC in astrocytes in the cortex impaired coordination in R6/1 mice, as evidenced in the vertical pole test, while motor learning improved in WT mice, assessed by the accelerated rotarrod test. In addition, post-mortem analysis revealed an increase in GFAP expression only in WT mice after repeated stimulation and behavioral testing. Next, we examined motor behavior after stimulation of DdPAC in striatal astrocytes. In this case, the modulation of cAMP by DdPAC in astrocytes impaired coordination in both WT and R6/1 mice, while motor learning remained preserved. In addition, GFAP expression increased in both groups. Taken together, these results suggest that astrocytic modulation of DdPAC produces differentiated effects according to brain region and molecular context, with diverse results in the cortex and striatum in WT and R6/1 mice. In addition, our data suggest that increased cAMP levels in astrocytes may be detrimental in the context of HD, so strategies aimed at specifically reducing astrocytic cAMP could have more therapeutic potential. In parallel, we investigated the effects of cAMP signaling by DdPAC on neurons and astrocytes of the hippocampus, the most affected region in AD. To do this, we injected DdPAC into neurons and astrocytes in the hippocampus of WT and 5xFAD mice, followed by histological and proteomic analyses. Notably, histological analyses revealed a reduction in GFAP expression and amyloid-β deposits in the hippocampus where DdPAC had been activated in astrocytes, but not in regions with neuronal activation. Proteomic analysis of DdPAC-activated astrocytes revealed a response mainly associated with glial activation and immune response processes, as well as synaptic plasticity, while neuronal activation mostly influenced synaptic plasticity. In both cases, cytoskeletal regulation emerged as a key function, although the proteins involved differed between neurons and astrocytes. In addition, the effects of DdPAC activation, both in neurons and astrocytes, varied between WT and 5xFAD mice, indicating a differential effect depending on the molecular context. These results reinforce the idea that the effects of modulation by DdPAC depend on the brain region, molecular context and cell specificity. In summary, this thesis provides new knowledge about the cAMP pathway in synaptic plasticity and neurodegenerative diseases. First, our data demonstrate the participation of neuronal cAMP in behaviors related to the M2 cortex and reveal alterations in the dynamics of neuronal cAMP in mice with HD. In addition, we identify early motor and psychiatric deficits associated with the M2 cortex, highlighting the potential for therapeutic interventions in the early stages. To facilitate the application of therapies in the brain, we established a minimally invasive method for the administration of AAV that allows effective expression of the transgene in specific cell types and murine strains. Notably, we have demonstrated the ability of cAMP modulation by DdPAC to enhance synaptic plasticity in the cortex, especially when activated in astrocytes. In the context of neurodegeneration, the activation of DdPAC in HD and AD models produces differential effects: in HD, the activation of cortical astrocytes improves motor learning in WT mice but impairs coordination in mice with HD, while the activation of striatal astrocytes negatively affects coordination in both. In AD, increased cAMP in hippocampal astrocytes reduces astrogliosis and amyloid-β deposits, while neuronal activation reduces microglial reactivity. Proteomic analysis of hippocampal samples reveals differential changes induced by DdPAC in neurons and astrocytes, as well as between WT and AD mice, linking the activation of the cAMP-PKA pathway to synaptic plasticity and immune responses. In conclusion, this thesis reveals new functions of cAMP signaling and proposes it as a promising therapeutic target in neurodegenerative diseases. Our results demonstrate that the modulation of cAMP by DdPAC in neurons and astrocytes has a profound impact on neuronal plasticity, with the modulation of cAMP-PKA in astrocytes producing the broadest effects. In addition, we highlight the importance of the brain region and the molecular context in the results of cAMP modulation, since the activation of DdPAC produces differentiated effects in the cortex, striatum and hippocampus, and according to the pathological state. Ultimately, we provide strong evidence that positions DdPAC as a versatile tool to modulate cAMP-PKA signaling, with potential applications in both neuroscience research and therapeutic development.

[cat] Amb l’envelliment de la població, les malalties neurodegeneratives representen un problema creixent de salut pública, que podria derivar en una càrrega social i econòmica insostenible si les tendències actuals persisteixen. Sorprenentment, la majoria d’aquestes malalties no tenen cura i ni tan sols un tractament efectiu que millori la qualitat de vida de les persones afectades. Una característica distintiva dels trastorns neurodegeneratius és la disfunció sinàptica, que apareix tot i l’absència de pèrdua neuronal, i està provocada per l’acumulació de proteïnes mal plegades, la qual cosa condueix a alteracions moleculars, de circuits i funcionals (Palop 2006). No obstant això, els mecanismes exactes que provoquen aquestes alteracions específiques encara no es comprenen del tot. Això posa de manifest la necessitat d’aprofundir en la comprensió d’aquestes malalties i, encara més important, la necessitat urgent de desenvolupar noves estratègies terapèutiques, potencialment basades en la modulació de la plasticitat cerebral. En aquesta tesi, ens hem centrat en dues malalties neurodegeneratives: la malaltia de Huntington (MH) i la malaltia d’Alzheimer (MA). La MH és un trastorn neurodegeneratiu genètic autosòmic dominant, caracteritzat per una degeneració progressiva de les regions estriatals i corticals del cervell (Huntington, 2003; Walker, 2007). La malaltia es manifesta amb dèficits motors com la corea, la distonia i la descoordinació, així com amb deteriorament cognitiu i alteracions psiquiàtriques. La MH està causada per una mutació en el gen de la huntingtina (HTT), amb una repetició expandida del triplet CAG que dona lloc a una forma mutada de la proteïna huntingtina (mHTT), la qual condueix a la neurodegeneració (The Huntington’s Disease Collaborative Research Group, 1993a). La MH es caracteritza per una pèrdua neuronal selectiva i una plasticitat sinàptica deteriorada, especialment en l’escorça cerebral i l’estriat, on les neurones espinoses mitjanes són especialment vulnerables (Vonsattel & DiFiglia, 1998). La disrupció de la via escorça-estriat, que té un paper fonamental en les funcions motores i cognitives, contribueix als símptomes de la malaltia (Cepeda et al., 2007). L’MA, per la seva banda, és la causa principal de demència i es caracteritza per un deteriorament progressiu de la memòria, així com per alteracions del llenguatge, la funció executiva i les habilitats visuoespacials (Scheltens et al., 2021; Stelzmann et al., 1995). L’MA es classifica en familiar, causada per mutacions en gens com APP, PSEN1 i PSEN2, amb un inici precoç que representa menys del 0,5% dels casos, i MA esporàdica, que representa el 99,5% dels casos i està influïda per factors genètics, ambientals i d’estil de vida (Bateman et al., 2011; Bertram et al., 2010). L’MA es caracteritza per la presència de plaques amiloides, cabdells neurofibril·lars i neuroinflamació. La disfunció sinàptica, especialment a l’hipocamp, es correlaciona de manera directe amb el deteriorament cognitiu observat en l’MA (Querfurth & LaFerla, 2010). Per tant, la plasticitat sinàptica constitueix una alteració primerenca en ambdues malalties, fet que destaca la necessitat de desenvolupar estratègies terapèutiques que específicament es focalitzin en aquests canvis inicials. La plasticitat sinàptica és el mecanisme mitjançant el qual les connexions sinàptiques al cervell s’enforteixen o s’afebleixen en resposta a diversos estímuls. Les alteracions en aquest procés constitueixen una de les principals característiques de la MH i la MA, contribuint de manera significativa als dèficits funcionals observats en aquestes patologies (J. Y. Li et al., 2003; Selkoe, 2002). En la plasticitat sinàptica a llarg termini, l’activació dels receptors per neurotransmissors desencadena vies de senyalització que afavoreixen l’enfortiment sinàptic, sovint associades a l’entrada de calci. Un component clau d’aquest enfortiment és la inserció de nous receptors a la membrana postsinàptica, un procés que requereix l’activitat de proteïnes quinases i la síntesi local de proteïnes. Més enllà del calci, una altra molècula de senyalització fonamental pel manteniment de la plasticitat és el monofosfat d’adenosina cíclic (AMPc). L’AMPc és modulat per l’activitat de receptors metabotròpics i, entre múltiples dianes, activa la proteïna quinasa A (PKA), la qual fosforila factors de transcripció com CREB, iniciant així l’expressió gènica necessària per a les modificacions sinàptiques a llarg termini (Benito & Barco, 2010). A més, la via de senyalització AMPc-PKA és essencial per establir canvis estructurals a les sinapsis, i la seva activació s’ha associat amb una plasticitat sinàptica enfortida en diverses regions cerebrals (C. C. Huang & Hsu, 2006; Nguyen & Kandel, 1997). Paral·lelament, els astròcits també contribueixen a la plasticitat sinàptica. No obstant això, els mecanismes pels quals l’AMPc participa en la plasticitat sinàptica encara no s’han comprès del tot, ni tampoc el seu paper específic en neurones o astròcits. De fet, les alteracions en la senyalització de l’AMPc estan sent cada vegada més relacionades amb l’envelliment i amb malalties neurodegeneratives com MH i MH (Kelly, 2018). Tant la via escorça-estriat en MH com l’hipocamp en MH mostren disrupcions en la via de senyalització AMPc-PKA. En el cas de la MH, s’ha descrit una disminució de la senyalització de l’AMPc en l’escorça i l’estriat, i un augment a l’hipocamp, tot i que aquests resultats continuen sent controvertits. En canvi, en la MH està més ben establert que la senyalització d’AMPc disminueix a l’hipocamp, contribuint de manera clau al desenvolupament de la patologia associada a la demència. Davant les controvèrsies sobre el paper d’AMPc en MH, i considerant la gran importància de l’escorça en aquesta malaltia, el nostre primer objectiu és caracteritzar les alteracions en la senyalització d’AMPc i el comportament associat amb l’escorça del model murí R6/1 per a la malaltia. Per tant, estratègies dirigides a potenciar la plasticitat sinàptica mitjançant la modulació de la senyalització de l’AMPc podrien tenir un gran potencial per mitigar o retardar la disfunció de xarxes neuronals associada a trastorns neurodegeneratius com la MH i la MA. En aquest sentit, les eines optogenètiques permeten un control precís de mecanismes biològics mitjançant proteïnes sensibles a la llum. Particularment, les adenilat ciclases fotoactivades (PACs) són enzims que augmenten els nivells d’AMPc en resposta a la llum, mitjançant un domini d’adenilat ciclasa acoblat a un mòdul fotorreceptor (Iseki & Park, 2021). Entre aquestes, la DdPAC és una PAC recentment optimitzada que regula els nivells d’AMPc en resposta a llum vermella (Stüven et al., 2018). Desenvolupada inicialment en bacteris, la DdPAC ha demostrat una resposta a la llum més potent en comparació amb altres PACs sensibles a la llum vermella. No obstant això, la seva aplicació en cèl·lules cerebrals i in vivo encara no ha estat explorada. Considerant la capacitat de la llum vermella per penetrar en els teixits amb una dispersió mínima, DdPAC representa una eina prometedora per a aplicacions no invasives. Per tant, el nostre segon objectiu és establir l’ús de DdPAC com a eina optogenètica per modular la plasticitat sinàptica in vivo, de manera no invasiva. D’altra banda, donada la vulnerabilitat regional i les diferències patofisiològiques observades entre MH i la AD, que poden afectar a la modulació d’AMPc i plasticitat sinàptica, el nostre tercer objectiu és restaurar la funció fisiològica mitjançant l’estimulació lumínica de DdPAC en models murins de totes dues malalties. En aquest cas, l’atenció se centrarà en les regions més afectades en cada patologia: l’estriat i l’escorça en el cas de la MH, i l’hipocamp en la MA. Tenint en compte aquesta informació, l'objectiu principal d'aquesta tesi és restaurar la funció fisiològica en malalties neurodegeneratives mitjançant la modulació de la plasticitat cerebral a través de l'activació lumínica de la senyalització d’AMPc, mediada per DdPAC, en circuits cerebrals específics Per assolir el nostre primer objectiu i caracteritzar les alteracions en la senyalització d’AMPc i el comportament relacionat amb l’escorça en el model murí R6/1 de la malaltia de Huntington, primer vam avaluar les alteracions d’AMPc en l’escorça durant tasques de comportament relacionades amb la via escorça-estriat en ratolins R6/1. Per investigar la dinàmica d’AMPc, vam realitzar enregistraments de fibre photometry utilitzant el sensor GFlamp-1, un nou sensor d’AMPc, en neurones de l’escorça M2 de ratolins mascles i femelles WT i R6/1 de 14 i 20 setmanes d’edat, durant les tasques de beetle-mania (BMT) i rotarod accelerant (ARR). Primer vam avaluar la dinàmica d’AMPc durant la BMT, observant un increment dels nivells d’AMPc tant en els ratolins WT com en els R6/1 després de la introducció de l’escarabat. Malgrat que els ratolins R6/1 ja mostraven un comportament alterat durant el test, no es van detectar diferències en els nivells d’AMPc entre els genotips. Aquestes dades revelen la implicació de la senyalització neuronal d’AMPc durant la BMT, amb alteracions mínimes en els ratolins R6/1. Posteriorment, per entendre millor la contribució d’AMPc en tasques relacionades amb l’escorça M2, vam explorar la dinàmica d’AMPc durant l’ARR. Els nostres resultats estaven en línia amb els observats durant la BMT, ja que els nivells d’AMPc neuronal tant en ratolins WT com R6/1 augmentaven amb l’inici de la tasca. A diferència dels resultats obtinguts amb la BMT, en aquest cas vam observar una sobre-activació aberrant de l’escorça M2 en els ratolins R6/1. Finalment, per esbrinar si les alteracions en l’activitat d’AMPc durant tasques relacionades amb M2 són més evidents en etapes més avançades de la malaltia, vam repetir la BMT en la mateixa cohort de ratolins a les 20 setmanes, quan els animals són plenament simptomàtics. A aquesta edat, encara vam poder observar un augment d’AMPc neuronal en WT i R6/1 després de la introducció de l’escarabat. No obstant això, aquest increment fou significativament menor en els ratolins R6/1. En conjunt, aquests resultats destaquen la implicació d’AMPc neuronal en tasques relacionades amb l’escorça M2 i mostren alteracions en el context de la MH. Atesa la importància crítica de l’escorça M2 en la fisiopatologia de la MH, també vam voler determinar si sorgeixen símptomes addicionals associats a la disfunció escorça-estriat en les primeres etapes de la malaltia en el model R6/1. Per fer-ho, vam seleccionar dues proves conductuals, el adhesive removal test i el marble-burying test, ambdues relacionades amb l’escorça M2 i la via escorça-estriat, i les vam dur a terme longitudinalment des de les 4 fins a les 16 setmanes d’edat. En el adhesive removal test, relacionat amb la via escorça M2–escorça somatosensorial–estriat, vam observar dèficits motors des de les 8 setmanes, mentre que els dèficits somatosensorials van aparèixer a les 16 setmanes. En el marble-burying test, relacionat amb la via escorça M2–escorça orbitofrontal–estriat, vam observar un comportament similar a l’anhedònia des de les 8 setmanes. Aquestes dades indiquen que la disfunció de la via escorça-estriat sorgeix en estadis molt primerencs, remarcant el potencial de les intervencions terapèutiques precoces. Globalment, els resultats d’aquest primer objectiu indiquen que la disfunció de la via escorça-estriat relacionada amb l’escorça M2 emergeix en estadis inicials de la malaltia, destacant el potencial de les intervencions terapèutiques en fases primerenques. Atès que la senyalització d’AMPc neuronal es manté funcional en ratolins amb comportament alterat, és poc probable que sigui la responsable directa dels dèficits conductuals relacionats amb M2, suggerint que altres mecanismes podrien estar involucrats. Per assolir el segon objectiu i implementar la DdPAC com a nova eina optogenètica per modular la plasticitat sinàptica de manera no invasiva a través de la senyalització d’AMPc, primer vam voler establir un mètode mínimament invasiu per a la seva administració al cervell a través de vectors AAV. Per això, vam dissenyar constructes vírics amb GFP sota tres promotors diferents (CAG, CamKIIa i FLEXon), i les vam administrar utilitzant dos serotips d’AAV (AAV9 i PHP.eB), en dues soques de ratolins diferents (C57BL/6J i B6CBA), i mitjançant tres vies d’administració, de més a menys invasiva (intra-cranial, retro-orbital i intra-nasal). En resum, l’expressió de GFP es va detectar en diverses regions cerebrals i en tipus cel·lulars específics després de la injecció retro-orbital dels vectors PHP.eB i AAV9, mostrant el serotip PHP.eB una infecció més àmplia. A més, vam aconseguir expressar els constructes vírics de PHP.eB en dues soques murines i específicament en el nostre model R6/1. A més, la injecció retro-orbital en ratolins A2a-Cre va resultar en una transducció regional específica, demostrant el seu potencial per dirigir circuits específics. Tanmateix, no es va observar fluorescència de GFP després de l’administració intra-nasal en cap dels casos. Aquests resultats posen de manifest la injecció retro-orbital com una via mínimament invasiva per arribar a regions cerebrals de manera eficient i en diferents tipus cel·lulars i soques de ratolins, oferint una alternativa a la cirurgia estereotàxica. No obstant això, cal recerca addicional sobre la modificació de càpsides virals per facilitar la infecció de cèl·lules neurals via administració intra-nasal. Per continuar amb aquest objectiu, vam caracteritzar els efectes de l’activació de DdPAC en tipus cel·lulars específics del cervell. En primer lloc, vam investigar si la modulació de AMPc mitjançant DdPAC era capaç d’afavorir la plasticitat sinàptica. Per això, vam injectar DdPAC sota els promotors CamKIIa o GFAP a l’escorça per expressar-la selectivament en neurones i astròcits, respectivament, i posteriorment vam realitzar enregistraments amb matrius d’electrodes múltiples (MEAs). La il·luminació amb llum vermella va aconseguir potenciar l’activitat neuronal tant en l’activació neuronal com astroglial de la DdPAC, tot i que l’efecte va ser més pronunciat quan aquesta s’activava en astròcits. Per aquest motiu, els experiments següents d’aquest objectiu es van centrar en investigar l’activació de DdPAC en astròcits corticals. Així, vam caracteritzar el mecanisme subjacent d’aquesta potenciació, demostrant que l’augment d’AMPc induït per DdPAC és dependent de PKA i NMDAR, però independent del calci, requereix activitat sinàptica, i indueix gliotransmissió de glutamat. Per aprofundir en els efectes in vivo de l’activació astroglial de la DdPAC, vam realitzar anàlisis de fosfoproteòmica i proteòmica. Les dades òmiques van validar la implicació de la via AMPc-PKA en els efectes astroglials de la DdPAC, recolzant el seu paper central en la plasticitat sinàptica, alhora que revelant un efecte cerebral ampli derivat de l’activació dels astròcits. En conjunt, les dades del segon objectiu posicionen la DdPAC com una eina potent per modular la plasticitat sinàptica al cervell mitjançant la manipulació dirigida de la via AMPc-PKA en astròcits, alhora que estableixen un mètode robust i mínimament invasiu per a la seva aplicació in vivo. Finalment, vam abordar el nostre tercer objectiu: restaurar la funció fisiològica mitjançant l’estimulació lumínica de DdPAC en models murins de la MH i la MA. En primer lloc, vam investigar els efectes funcionals de l’activació astrocítica de DdPAC en dues de les regions més afectades en la MH: l’escorça cerebral i l’estriat. Per a això, vam injectar DdPAC en astròcits corticals o estriatals del model murí R6/1 per avaluar la seva capacitat de modular la funció cerebral. En els experiments d’estimulació cortical, es van analitzar els canvis hemodinàmics mitjançant una tècnica d’imatge basada en dispersió de llum i, posteriorment, es va avaluar el comportament motor. L’anàlisi hemodinàmica va revelar una sobre-activació de l’escorça després de l’activació aguda de DdPAC en astròcits de l’escorça dels ratolins R6/1, una resposta que no es va observar en ratolins control. A més, l’estimulació repetida de DdPAC en astròcits de l’escorça va deteriorar la coordinació en ratolins R6/1, tal com es va evidenciar en el test del pal vertical (vertical pole), mentre que va millorar l’aprenentatge motor en ratolins WT, avaluat mitjançant el test de rotarrod accelerat. A més, l’anàlisi post-mortem va revelar un augment en l’expressió de GFAP només en ratolins WT després de l’estimulació repetida i les proves conductuals. Tot seguit, vam examinar el comportament motor després de l’estimulació de DdPAC en astròcits estriatals. En aquest cas, la modulació d’AMPc mitjançant DdPAC en astròcits va deteriorar la coordinació tant en ratolins WT com R6/1, mentre que l’aprenentatge motor es va mantenir preservat. A més, l’expressió de GFAP va augmentar en ambdós grups. En conjunt, aquests resultats suggereixen que la modulació astrocítica de DdPAC produeix efectes diferenciats segons la regió cerebral i el context molecular, amb resultats diversos a l’escorça i a l’estriat en ratolins WT i R6/1. A més, les nostres dades suggereixen que l’augment dels nivells d’AMPc en astròcits pot ser perjudicial en el context de la HD, de manera que estratègies dirigides a reduir específicament l’AMPc astrocític podrien tenir més potencial terapèutic. En paral·lel, vam investigar els efectes de la senyalització d’AMPc mitjançant DdPAC en neurones i astròcits de l’hipocamp, la regió més afectada en la MA. Per a això, vam injectar DdPAC en neurones i astròcits de l’hipocamp de ratolins WT i 5xFAD, seguit d’anàlisis histològiques i proteòmiques. Notablement, les anàlisis histològiques van revelar una reducció en l’expressió de GFAP i en els dipòsits d’amiloide-β a l’hipocamp on s’havia activat DdPAC en astròcits, però no en les regions amb activació neuronal. L’anàlisi proteòmica d’astròcits activats per DdPAC va revelar una resposta principalment associada a processos d’activació glial i resposta immunitària, així com a plasticitat sinàptica, mentre que l’activació neuronal va influenciar majoritàriament la plasticitat sinàptica. En ambdós casos, la regulació del citoesquelet va emergir com una funció clau, tot i que les proteïnes implicades diferien entre neurones i astròcits. A més, els efectes de l’activació de DdPAC, tant en neurones com en astròcits, van variar entre ratolins WT i 5xFAD, indicant un efecte diferencial depenent del context molecular. Aquests resultats reforcen la idea que els efectes de la modulació mitjançant DdPAC depenen de la regió cerebral, del context molecular i de l’especificitat cel·lular. En resum, aquesta tesi aporta nous coneixements sobre la via d’AMPc en la plasticitat sinàptica i les malalties neurodegeneratives. En primer lloc, les nostres dades demostren la participació d’AMPc neuronal en comportaments relacionats amb l’escorça M2 i revelen alteracions en la dinàmica d’AMPc neuronal en ratolins amb HD. A més, identifiquem dèficits motors i psiquiàtrics precoços associats a l’escorça M2, posant en relleu el potencial per a intervencions terapèutiques en fases inicials. Per facilitar l’aplicació de teràpies en el cervell, establim un mètode mínimament invasiu per a l’administració d’AAV que permet una expressió eficaç del transgen en tipus cel·lulars i soques murines específiques. Notablement, hem demostrat la capacitat de la modulació d’AMPc mitjançant DdPAC per potenciar la plasticitat sinàptica en escorça, especialment quan s’activa en astròcits. En el context de la neurodegeneració, l’activació de DdPAC en models de la MH i MA produeix efectes diferencials: en la MH, l’activació d’astròcits corticals millora l’aprenentatge motor en ratolins WT però deteriora la coordinació en ratolins amb MH, mentre que l’activació d’astròcits estriatals afecta negativament la coordinació en ambdós. En la MA, l’augment d’AMPc en astròcits de l’hipocamp redueix l’astrogliosi i els dipòsits d’amiloide-β, mentre que l’activació neuronal redueix la reactivitat microglial. L’anàlisi proteòmica de mostres hipocampals revela canvis diferencials induïts per DdPAC en neurones i astròcits, així com entre ratolins WT i AD, vinculant l’activació de la via AMPc-PKA a la plasticitat sinàptica i les respostes immunitàries. En conclusió, aquesta tesi revela noves funcions de la senyalització d’AMPc i la proposa com una diana terapèutica prometedora en malalties neurodegeneratives. Els nostres resultats demostren que la modulació d’AMPc mitjançant DdPAC en neurones i astròcits té un impacte profund en la plasticitat neuronal, sent la modulació d’AMPc-PKA en astròcits la que produeix efectes més amplis. A més, destaquem la importància de la regió cerebral i del context molecular en els resultats de la modulació d’AMPc, ja que l’activació de DdPAC produeix efectes diferenciats a l’escorça, estriat i hipocamp, i segons l’estat patològic. En última instància, aportem una evidència sòlida que posiciona DdPAC com una eina versàtil per modular la senyalització d’AMPc-PKA, amb aplicacions potencials tant en recerca en neurociència com en desenvolupament terapèutic.