Hyperglycemia-associated alterations in b; cell autophagy and mitochondrial function: implications for antigen presentation and human type 1 diabetes

Abstract

Els mecanismes moleculars i cel·lulars que condueixen al reconeixement d’autoantígens en la diabetis tipus 1 encara no es coneixen amb precisió. L’objectiu d’aquesta tesi és explorar les possibles fonts d’autoantígens que configuren l’immunopeptidoma derivat de les cèl·lules β, així com analitzar com l’estrès cel·lular pot ocasionar alteracions significatives en aquest context. Al primer capítol es va comparar el proteoma pancreàtic de pacients amb diabetis tipus 1 en diferents fases de la malaltia per identificar processos biològics clau alterats. Centrant-se en les etapes inicials, es va observar que el pàncrees d’un pacient en debut precoç presentava alteracions en la funció endocrina i exocrina, en concordança amb el descrit a la bibliografia. També es va detectar una regulació a l’alça de l’estrès del reticle endoplasmàtic, de la resposta a proteïnes desplegades (UPR) i, de manera destacada, de proteïnes mitocondrials. Posteriorment, es van estimular cèl·lules dendrítiques derivades de monòcits (moDCs) portadores de l’al·lel HLA-DR4 —associat al risc de desenvolupament de la diabetis tipus 1— amb els mateixos extractes pancreàtics. Es van identificar pèptids derivats de proteïnes regulades positivament o negativament en els proteomes corresponents; entre ells, es van trobar pèptids procedents de diverses proteïnes mitocondrials. Al segon capítol es van estudiar les alteracions induïdes per la hiperglucèmia, amb atenció als crinosomes de cèl·lules β i grànuls secretors d’insulina. El cultiu hiperglucèmic de la línia HP62 va revelar un augment de l’estrès del reticle endoplasmàtic, una reducció del flux autofàgic i canvis en el proteoma dels crinosomes. Aquests canvis suggerien un increment en el trànsit i recanvi proteic, així com en l’eliminació d’espècies reactives d’oxigen (ROS). L’estimulació de moDCs amb al·lel HLA-DR4 va demostrar que els crinosomes eren la principal font de pèptids derivats de cèl·lules β, ja que presentaven el nombre més gran de pèptids identificats de manera única. El pols amb mostres cultivades en condicions hiperglucèmiques va donar lloc a la presentació de pèptids exclusius derivats de les mateixes proteïnes parentals. Finalment, es van observar coincidències entre aquestes estimulacions i les realitzades amb extractes pancreàtics pel que fa a proteïnes parentals, incloses les mitocondrials. Al tercer capítol, atès que les proteïnes mitocondrials es van identificar de manera consistent en totes les mostres i condicions analitzades, i considerant la seva rellevància per a la funció de les cèl·lules β, es va fer una anàlisi detallada d’aquestes proteïnes. En primer lloc, es va constatar una disminució de les subunitats dels complexos I a IV de la cadena de transport d’electrons (ETC) en l’etapa de debut precoç de la diabetis, acompanyada d’un augment de proteïnes proapoptòtiques i de la dinàmica mitocondrial. El cultiu hiperglucèmic de la línia HP62 va provocar una pèrdua de plasticitat mitocondrial, amb reducció de la formació de xarxes mitocondrials i un descens significatiu de paràmetres respiratoris. Aquests resultats s’alineen amb les alteracions detectades en els complexos de l’ETC i altres proteïnes mitocondrials al pàncrees de debut precoç. Finalment, els pèptids mitocondrials identificats en totes les estimulacions corresponien a proteïnes alterades per la hiperglucèmia i la progressió de la diabetis. En conjunt, aquesta tesi posa de manifest la rellevància dels compartiments cel·lulars de les cèl·lules β i de les mitocòndries com a actors clau en la seva funció i com a fonts d’autoantígens, mostrant que l’estrès cel·lular induït per la hiperglucèmia genera alteracions similars a les observades en mostres fisiològiques i contribueix a conformar l’immunopeptidoma derivat de les cèl·lules β. Encara que resta per dilucidar el paper definitiu dels pèptids identificats, aquestes troballes obren noves vies per comprendre els mecanismes implicats en el desenvolupament de la diabetis tipus 1 en humans.

Los mecanismos moleculares y celulares que conducen al reconocimiento de autoantígenos en la diabetes tipo 1 aún no se conocen con precisión. El objetivo de esta tesis es explorar las posibles fuentes de autoantígenos que configuran el inmunopeptidoma derivado de las células β, así como analizar cómo el estrés celular puede ocasionar alteraciones significativas en este contexto. En el primer capítulo se comparó el proteoma pancreático de pacientes con diabetes tipo 1 en distintas fases de la enfermedad para identificar procesos biológicos clave alterados. Centrándose en las etapas iniciales, se observó que el páncreas de un paciente en debut temprano presentaba alteraciones en la función endocrina y exocrina, en concordancia con lo descrito en la bibliografía. También se detectó una regulación al alza del estrés del retículo endoplásmico, de la respuesta a proteínas desplegadas (UPR) y, de manera destacada, de proteínas mitocondriales. Posteriormente, se estimularon células dendríticas derivadas de monocitos (moDCs) portadoras del alelo HLA-DR4 —asociado al riesgo de desarrollo de diabetes tipo 1— con los mismos extractos pancreáticos. Se identificaron péptidos derivados de proteínas reguladas positiva o negativamente en los proteomas correspondientes; entre ellos, se hallaron péptidos procedentes de varias proteínas mitocondriales. En el segundo capítulo se estudiaron las alteraciones inducidas por la hiperglucemia, con atención a crinosomas de células β y gránulos secretores de insulina. El cultivo hiperglucémico de la línea HP62 reveló un aumento del estrés del retículo endoplásmico, una reducción del flujo autofágico y cambios en el proteoma de los crinosomas. Dichos cambios sugirieron incremento en el tráfico y recambio proteico, así como en la eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS). La estimulación de moDCs con alelo HLA-DR4 demostró que los crinosomas eran la principal fuente de péptidos derivados de células β, al presentar el mayor número de péptidos identificados de manera única. El pulso con muestras cultivadas en condiciones hiperglucémicas dio lugar a la presentación de péptidos exclusivos derivados de las mismas proteínas parentales. Finalmente, se observaron coincidencias entre estas estimulaciones y las realizadas con extractos pancreáticos en cuanto a proteínas parentales, incluidas proteínas mitocondriales. En el tercer capítulo, dado que las proteínas mitocondriales se identificaron consistentemente en todas las muestras y condiciones analizadas, y considerando su relevancia para la función de las células β, se realizó un análisis detallado de estas proteínas. En primer lugar, se constató una disminución de las subunidades de los complejos I a IV de la cadena de transporte de electrones (ETC) en la etapa de debut temprano de la diabetes, acompañada de un aumento de proteínas proapoptóticas y de la dinámica mitocondrial. El cultivo hiperglucémico de la línea HP62 provocó una pérdida de plasticidad mitocondrial, con reducción de la formación de redes mitocondriales y descenso significativo de parámetros respiratorios. Estos hallazgos se alinean con las alteraciones detectadas en los complejos de la ETC y otras proteínas mitocondriales en el páncreas de debut temprano. Finalmente, los péptidos mitocondriales identificados en todas las estimulaciones correspondieron a proteínas alteradas por la hiperglucemia y la progresión de la diabetes. En conjunto, esta tesis pone de manifiesto la relevancia de los compartimentos celulares de las células β y de las mitocondrias como actores clave en su función y como fuentes de autoantígenos, mostrando que el estrés celular inducido por la hiperglucemia genera alteraciones similares a las observadas en muestras fisiológicas y contribuye a conformar el inmunopeptidoma derivado de las células β. Aunque aún queda por dilucidar el papel definitivo de los péptidos identificados, estos hallazgos abren nuevas vías para comprender los mecanismos implicados en el desarrollo de la diabetes tipo 1 en humanos.

The molecular and cellular mechanisms leading to the recognition of autoantigens in type 1 diabetes are still unknown. In this thesis the aim is to explore the possible autoantigen sources that shape the -cell-derived immunopeptidome and how cell stress can lead to significant alterations in this sense. In chapter one, the pancreas proteome of type 1 diabetes patients at different stages of the disease were compared in order to identify key altered biological processes. Focused on the initial stages of the disease, it was found that the pancreas from the early debut patient exhibited alterations in endocrine and exocrine function coherent with known bibliography. Upregulation of ER stress, the UPR and, noteworthy, mitochondrial proteins were also found to be significant. Then, moDCs expressing the HLA-DR4 allele, related to type 1 diabetes development risk, were pulsed with the same pancreas extracts. Identified peptides derived from proteins found to be up or downregulated in the corresponding proteomes; peptides derived from several mitochondrial proteins were also detected. In chapter two, alterations following hyperglycemia are studied with an emphasis on  cell crinosomes and insulin secretory granules. Increased ER stress, reduced autophagic flux and changes at proteome level in crinosomes were detected following hyperglycemic culture of the HP62 cell line. Proteome changes suggested increased protein trafficking, protein turnover and removal of ROS. Pulsing of moDCs expressing the HLA-DR4 allele showed that crinosomes were the main source of -cell-derived peptides, having the highest number of uniquely identified peptides. Pulses with hyperglycemia-cultured samples resulted in the presentation of unique peptides derived from the same parental proteins. Finally, coincidences between these pulses and pancreas pulses in terms of parental proteins were detected, with mitochondrial proteins found among them. In chapter three, considering the presence of mitochondrial proteins in all samples and conditions assessed and their relevance to cell function, a detailed analysis regarding these proteins was performed. First, subunits of the ETC complexes I to IV were found to be decreased in the early debut diabetes stage together with increased pro-apoptotic proteins and mitochondrial dynamism. Hyperglycemic culture of the HP62 cell line caused a loss of mitochondrial plasticity, with decreased mitochondrial network formation and a significant reduction of respiration parameters. These findings were aligned with the affectations in ETC complexes and other mitochondrial proteins detected in the early debut pancreas. Finally, mitochondrial peptides identified in all pulses corresponded to proteins altered with hyperglycemia and/or diabetes advancement. In summary, this thesis demonstrates the relevance of  cell compartments and mitochondria as key players in cell function and as autoantigen sources, with cell stress triggered by hyperglycemia causing alterations similar to the ones found in physiological samples and shaping the -cell-derived immunopeptidome. Although the final role the identified peptides remains to be elucidated, these findings open various ways for understanding the mechanisms involved in the development of human type 1 diabetes.