Caracterización de las alteraciones inmunológicas de células Treg en pacientes pediátricos con errores innatos de la inmunidad, hacia terapias dirigidas

Abstract

Els trastorns primaris de regulació immunitària (PIRD) constitueixen un grup emergent i heterogeni dins dels errors innats de la immunitat (EII), caracteritzats per autoimmunitat, limfoproliferació i disfunció immune multiorgànica. La seva complexitat clínica i molecular representa un desafiament important per al diagnòstic precoç i el maneig terapèutic individualitzat.

Mètodes: Es va dur a terme un estudi multicèntric observacional prospectiu que va incloure 51 pacients pediàtrics que complien criteris clínics de PIRD, amb mostres de sang perifèrica recollides en tres punts temporals (T0, T1 i T2) i 6 controls sans. Es va aplicar citometria de flux multiparamètrica per caracteritzar de manera exhaustiva 114 poblacions immunes, centrant-se en el perfil immunofenotípic i la funcionalitat de les cèl·lules T reguladores (Treg). A més, es van emprar models d’aprenentatge automàtic per a la estratificació immunològica. Paral·lelament, es va realitzar una anàlisi exploratòria mitjançant un kit funcional de fosfoproteïnes, amb potencial per a la monitorització clínica i el disseny de teràpies personalitzades, així com assaigs funcionals in vitro en PBMCs humanes amb immunosupressors d’ús clínic habitual (sirolimus, ruxolitinib, micofenolat de mofetil, leniolisib i tacròlimus).

Resultats: L’estudi va revelar una heterogeneïtat immunològica marcada en els pacients amb PIRD, evidenciada tant en el perfil fenotípic com en la resposta funcional indirecta de les Treg. Es van identificar biomarcadors diferencials robustos (com CD4+ EM, CD4+ CM, CD4+ RTE i cèl·lules NK CD56+ CD16+) capaços de discriminar entre pacients, controls i subgrups clínics. Tot i que no van assolir significació estadística, les subpoblacions Treg CM i Treg EM podrien tenir un paper rellevant en la regulació immune alterada observada en els pacients, suggerint que la seva presència, tot i poc abundant, s’associa a patrons immunològics distintius que mereixen atenció en futures investigacions. Es va observar una sobreexpressió de nivells cel·lulars de diferents poblacions immunoreguladores i subtipus Treg, així com de marcadors immunoreguladors (CTLA-4, PD-1, IL-10, TIGIT, LAP) en cèl·lules Treg i CD4+ no-Treg dels pacients PIRD en comparació amb controls sans, suggerint una activació immune compensatòria desorganitzada, corroborada per xarxes de coexpressió fragmentades. L’estudi de fosfoproteïnes va aportar una caracterització preliminar del perfil de senyalització intracel·lular en condicions basals i després d’estimulació, obrint la via a estratègies de monitoratge funcional. Els assaigs amb immunosupressors van mostrar alteracions subtils en la distribució de subpoblacions T, encara que sense canvis estadísticament significatius a nivell fenotípic.

Conclusions: Aquesta tesi proposa un marc clínic-immunològic integral per a la caracterització dels pacients amb PIRD, combinant eines avançades d’immunofenotipat, anàlisi funcional i modelització computacional. S’identifiquen biomarcadors i patrons immunològics amb utilitat potencial en l’estratificació diagnòstica i en la presa de decisions terapèutiques. El treball estableix les bases per al desenvolupament d’algoritmes clínics orientats al diagnòstic precoç i al disseny de teràpies immunomoduladores personalitzades en immunologia pediàtrica. La integració del perfil immunofenotípic i la funció Treg emergeix com un eix central per avançar cap a una medicina de precisió en els errors innats de la immunitat amb fenotips de disregulació.

Los trastornos primarios de regulación inmunitaria (PIRD) constituyen un grupo emergente y heterogéneo dentro de los errores innatos de la inmunidad (EII), caracterizados por autoinmunidad, linfoproliferación y disfunción inmune multiorgánica. Su complejidad clínica y molecular supone un desafío importante para el diagnóstico precoz y el manejo terapéutico individualizado.

Métodos: Se llevó a cabo un estudio multicéntrico observacional prospectivo que incluyó 51 pacientes pediátricos que cumplían criterios clínicos de PIRD, con muestras de sangre periférica recogidas en tres tiempos (T0, T1 y T2) y 6 controles sanos. Se aplicó citometría de flujo multiparamétrica para caracterizar de forma exhaustiva 114 poblaciones inmunes, centrándose en el perfil inmunofenotípico y la funcionalidad de las células T reguladoras (Treg). Además, se emplearon modelos de aprendizaje automático para la estratificación inmunológica. En paralelo, se llevó a cabo un análisis exploratorio mediante un kit funcional de fosfoproteínas, con potencial para la monitorización clínica y el diseño de terapias personalizadas, así como ensayos funcionales in vitro en PBMCs humanas con inmunosupresores de uso clínico habitual (sirolimus, ruxolitinib, micofenolato de mofetil, leniolisib y tacrolimus).

Resultados: El estudio reveló una heterogeneidad inmunológica marcada en los pacientes con PIRD, evidenciada tanto en el perfil fenotípico como en la respuesta funcional indirecta de las Treg. Se identificaron biomarcadores diferenciales robustos (como CD4+ EM, CD4+ CM, CD4+ RTE y células NK CD56+ CD16+) capaces de discriminar entre pacientes, controles y subgrupos clínicos. Aunque no alcanzaron significación estadística, las subpoblaciones Treg CM y Treg EM podrían tener un papel relevante en la regulación inmune alterada observada en pacientes, sugiriendo que su presencia, aunque poco abundante, está asociada a patrones inmunológicos distintivos que merecen atención en futuras investigaciones. Específicamente, se observó una sobreexpresión de niveles celulares de diferentes poblaciones inmunorreguladoras y subtipos Treg, así como de marcadores inmunorreguladores (CTLA-4, PD-1, IL-10, TIGIT, LAP) en células Treg y CD4+ no-Treg de pacientes PIRD frente a controles sanos, lo que sugiere una activación inmunitaria compensatoria desorganizada, corroborada por redes de coexpresión fragmentadas. El estudio de fosfoproteínas aportó una caracterización preliminar del perfil de señalización intracelular en condiciones basales y tras estimulación, abriendo la vía a estrategias de inmunomonitorización funcional. Por su parte, los ensayos con inmunosupresores mostraron alteraciones sutiles en la distribución de subpoblaciones T, aunque sin cambios estadísticamente significativos a nivel fenotípico.

Conclusiones: Esta tesis propone un marco clínico-inmunológico integral para la caracterización de los pacientes con PIRD, combinando herramientas avanzadas de inmunofenotipado, análisis funcional y modelización computacional. Se identifican biomarcadores y patrones inmunes con utilidad potencial en la estratificación diagnóstica y en la toma de decisiones terapéuticas. El trabajo sienta las bases para el desarrollo de algoritmos hospitalarios orientados al diagnóstico precoz y al diseño de terapias inmunomoduladoras personalizadas en inmunología pediátrica. La integración del perfil inmunofenotípico y la función Treg emerge como un eje central para avanzar hacia una medicina de precisión en los errores innatos de la inmunidad con fenotipos de disregulación.

Primary immune regulatory disorders (PIRD) represent an emerging and heterogeneous group within inborn errors of immunity (IEI), characterized by autoimmunity, lymphoproliferation, and multiorgan immune dysfunction. Their clinical and molecular complexity poses a significant challenge for early diagnosis and individualized therapeutic management.

Methods: A prospective multicenter observational study was conducted, including 51 pediatric patients who met clinical criteria for PIRD. Peripheral blood samples were collected at three time points (T0, T1, and T2), along with samples from 6 healthy controls. Multiparametric flow cytometry was applied to comprehensively characterize 114 immune cell populations, with a focus on the immunophenotypic profile and functional status of regulatory T cells (Treg). In addition, machine learning models were used for immunological stratification. In parallel, an exploratory analysis was conducted using a functional phosphoprotein kit with potential applications in clinical monitoring and personalized therapy design, along with in vitro functional assays on human PBMCs using commonly prescribed immunosuppressants (sirolimus, ruxolitinib, mycophenolate mofetil, leniolisib, and tacrolimus).

Results: The study revealed marked immunological heterogeneity in patients with PIRD, evidenced both by phenotypic profiles and by the indirect functional response of regulatory T cells (Tregs). Robust differential biomarkers (such as CD4+ EM, CD4+ CM, CD4+ RTE, and NK CD56+ CD16+ cells) were identified, capable of distinguishing between patients, healthy controls, and clinical subgroups. Although they did not reach statistical significance, the Treg CM and Treg EM subpopulations may play a relevant role in the altered immune regulation observed in patients, suggesting that their presence, though limited, is associated with distinctive immunological patterns that warrant further investigation. Specifically, there was an overexpression of cellular levels of various immunoregulatory populations and Treg subtypes, as well as immunoregulatory markers (CTLA-4, PD-1, IL-10, TIGIT, LAP) in Treg and CD4+ non-Treg cells from PIRD patients compared to healthy controls, suggesting a disorganized compensatory immune activation, corroborated by fragmented co-expression networks. The phosphoprotein analysis provided a preliminary characterization of intracellular signaling profiles under basal conditions and after stimulation, paving the way for future functional immunomonitoring strategies. Meanwhile, immunosuppressor assays revealed subtle alterations in the distribution of T cell subpopulations, although no statistically significant phenotypic changes were observed.

Conclusions: This thesis presents an integrated clinical-immunological framework for the characterization of PIRD patients, combining advanced immunophenotyping, functional assays, and computational modeling. Biomarkers and immune patterns with potential utility for diagnostic stratification and therapeutic decision-making were identified. The study lays the groundwork for the development of hospital-based algorithms aimed at early diagnosis and the design of personalized immunomodulatory therapies in pediatric immunology. The integration of immunophenotypic profiling with Treg function emerges as a central axis for advancing precision medicine in inborn errors of immunity with dysregulatory phenotypes.