Viscoelastic properties of C. reinhardtii flagella

Abstract

[eng] Eukaryotic flagella are slender organelles that protrude for the cell body of many organisms, ranging from microalga to animals. Flagella share a highly conserved structure arranged as a circular array of interlinked doublet microtubules and a central pair of microtubules. Molecular motors are regularly attached along the flagellum and produce doublet translation that turns into bending due to local constraints. Despite their significance in cell biology and physiology, the mechanism of coordination of these molecular motors into a regular waveform is still under debate. In particular, the feedback mechanism of the waveform onto the motors is unknown. Viscoelastic properties of flagella relate forces and torques to the shape of the flagellum, and are therefore crucial to understand this feedback mechanism, and ultimately the emergence of regular beating patterns. However our understanding of these mechanical properties remain parcellar. Flagella have been considered as homogeneous, isotropic Euler-Bernoulli beams. However, they display interdoublet shear resistance, basal compliance and might dissipate energy through internal friction. In fact, previous work focused primarily on static responses to external forcings. A dynamic analysis therefore seems necessary.

Beyond the flagellar level, coordination of multiple flagella, whether pertaining to the same cell or to different cells or organisms, is essential for biological functions such as motility, foraging, escaping or feeding current generation. Indeed, ciliary arrays often exhibit synchronized beating. Multiciliated tissues form metachronal waves that enhance fluid transport efficiency and biflagellate cilia like Chlamydomonas reinhardtii typically beat in phase to propel the phase forward. The physical origin of these coordinations is not fully understood. Metachronal waves seem to be of hydrodynamic origin, likewise for flagella belonging to different somatic cells in Volvox carteri. However, basal bodies -- flagellar anchorings to the cell body -- seem to determine the beating plane in Tetrahymena, while cytoplasmic actin and microtubule networks interacting with basal bodies are necessary for metachrony in \textit{Xenopus} embryo ciliated cells. At the single-cell level, Chlamydomonas can be phase-locked by an external flow much stronger than a typical flagellum-generated flow. In contrast, cell mutants lacking striated fibers connecting the basal bodies do not display synchronization, indicating that intracellular coupling is necessary and hydrodynamic coupling is not sufficient for synchronization for same-cell flagella.

Here we use the model organism Chlamydomonas reinhardtii to tackle these questions. In the first part, we develop a novel experiment that effectively makes interflagellar hydrodynamic coupling vanish with minute hydrodynamic effects. This setup allows us to probe the effect of intracellular mechanical coupling alone on synchronization. The results show that internal coupling is sufficient for In-Phase synchrony, whereas hydrodynamic coupling is necessary for Anti-Phase synchrony, naturally displayed by the flagellar dominance mutant ptx1. These findings shed light onto the mathematical structure of the synchronization process in those cells, in particular onto the origin of the noise in inter-flagellar dynamics, and its potential role in gait switching mechanism. In the second part, we develop a model that takes into account our current knowledge on viscoelastic properties of flagella, in particular basal degrees of freedom and internal dissipation. In order to infer static and dynamic mechanical properties, a background time-dependent flow is included. We then present an inference method based on a model reduction approach. We show that this approach allows to infer internal timescales of the system, and test it experimentally on passivated pipette-held Chlamydomonas cells under a time-dependent external flow driven by a piezoelectric stage. Together, these results deepen our understanding of mechanical properties and synchronization of flagella, and show the crucial role of basal bodies mechanical properties, perhaps biologically driven, to the coordination of the flagellar beat and between flagella.

[spa] Los flagelos eucariotas son orgánulos delgados de celulas de muchos organismos, desde microalgas hasta animales. Los flagelos comparten una estructura muy conservada dispuesta como un conjunto circular de microtúbulos en doblete entrelazados y un par central de microtúbulos. Los motores moleculares se unen regularmente a lo largo del flagelo y producen la traslación del doblete que se convierte en flexión debido a restricciones locales. A pesar de su importancia en la biología celulara, el mecanismo de coordinación de estos motores sigue estando en debate. En particular, se desconoce el mecanismo de retroalimentación de la onda sobre los motores. Las propiedades viscoelásticas de los flagelos relacionan las fuerzas con la forma del flagelo, por lo que son cruciales para comprender esta retroalimentación y la aparición de patrones de batido regulares. Sin embargo, nuestra comprensión de estas propiedades mecánicas sigue siendo parcelaria. Los flagelos se han considerado como haces de Euler-Bernoulli homogéneos e isótropos, pero muestran resistencia al cizallamiento entre dobletes, complacencia basal y podrían disipar energía internamente. De hecho, los trabajos anteriores se centraban principalmente en las respuestas estáticas a forzamientos externos. Por lo tanto, parece necesario un análisis dinámico.

Más allá del nivel flagelar, la coordinación de múltiples flagelos, ya pertenezcan a la misma célula o a células u organismos diferentes, es esencial para funciones biológicas como la motilidad o la generación de corriente alimentaria. De hecho, los conjuntos ciliares muestran a menudo un batido sincronizado. Los tejidos multiciliados forman ondas metacrónicas que mejoran la eficacia del transporte de fluidos y los cilios de biflagelados como Chlamydomonas reinhardtii suelen batir en fase para impulsar hacia delante. El origen físico de estas coordinaciones no se conoce del todo. Las ondas metacrónicas parecen ser de origen hidrodinámico, al igual que para los flagelos pertenecientes a diferentes células somáticas en Volvox carteri. Sin embargo, los cuerpos basales -- anclajes flagelares al cuerpo celular -- parecen determinar el plano de batido en Tetrahymena, mientras que las redes citoplasmáticas de actina y microtúbulos que interactúan con los cuerpos basales son necesarias para la metacronía en las células ciliadas embrionarias de Xenopus. A nivel unicelular, Chlamydomonas puede bloquearse en fase mediante un flujo externo mucho más fuerte que el típico flujo generado por el flagelo. Por el contrario, los mutantes celulares que carecen de fibras estriadas que conecten los cuerpos basales no muestran sincronización, indicando que el acoplamiento intracelular es necesario y que el acoplamiento hidrodinámico no es suficiente para la sincronización de los flagelos de una misma célula.

Aquí utilizamos el organismo Chlamydomonas reinhardtii para abordar estas cuestiones. Primero, desarrollamos un experimento que hace desaparecer el acoplamiento hidrodinámico. Así podemos sondear el efecto del acoplamiento mecánico intracelular por sí solo en la sincronización. Mostramos que el acoplamiento interno es suficiente para la sincronía In-Phase, mientras que el acoplamiento hidrodinámico es necesario para la sincronía Anti-Phase. Estos hallazgos arrojan luz sobre el proceso de sincronización en esas células, en particular sobre el origen del ruido en la dinámica interflagelar, y su papel potencial en la generación de la forma de onda. Segundo, desarrollamos un modelo que tiene en cuenta nuestros conocimientos actuales sobre las propiedades viscoelásticas de los flagelos. Para inferir las propiedades mecánicas, se incluye un flujo de fondo dependiente del tiempo. A continuación, presentamos un método de inferencia que permite inferir parametros del sistema. Lo probamos experimentalmente en células pasivadas, sujetas, y sometidas a un flujo externo dependiente del tiempo. En conjunto, estos resultados profundizan nuestra comprensión de las propiedades mecánicas y la sincronización de los flagelos, y muestran el papel crucial de las propiedades mecánicas de los cuerpos basales para la coordinación flagelar.

[cat] Els flagels eucariotes són orgànuls prims que sobresurten del cos cel·lular de molts organismes, des de microalgues fins a animals. Els flagels comparteixen una estructura molt conservada disposada com un conjunt circular de microtúbuls en doblet entrellaçats i un parell central de microtúbuls. Els motors moleculars s’uneixen regularment al llarg del flagel i produeixen la translació del doblet que es converteix en flexió a causa de restriccions locals. Malgrat la seva importància en la biologia cel·lular i la fisiologia, el mecanisme de coordinació d’aquests motors moleculars en una forma d’ona regular continua sent objecte de debat. En particular, es desconeix el mecanisme de retroalimentació de la forma d’ona sobre els motors. Les propietats viscoelàstiques dels flagels relacionen les forces i els parells amb la forma del flagel, per la qual cosa són crucials per a comprendre aquest mecanisme de retroalimentació i, en última instància, l’aparició de patrons de batecs regulars. No obstant això, la nostra comprensió d’aquestes propietats mecàniques continua sent parcel·lària. Els flagels s’han considerat com a feixos de Euler-Bernoulli homogenis i isòtrops. No obstant això, mostren resistència al cisallament entre doblets, complaença basal i podrien dissipar energia a través de la fricció interna. De fet, els treballs anteriors s’han centrat principalment en les respostes estàtiques a forçaments externs. Per tant, sembla necessari una anàlisi dinàmica. Més enllà del nivell flagel·lar, la coordinació de múltiples flagels, ja pertanyin a la mateixa cèl·lula o a cèl·lules o organismes diferents, és essencial per a funcions biològiques com la motilitat, la cerca d’aliment, la fugida o la generació de corrent alimentari. De fet, els conjunts ciliars mostren sovint un batec sincronitzat. Els teixits multiciliats formen ones metacròniques que milloren l’eficàcia del transport de fluids i els cilis de biflagelats com Chlamydomonas reinhardtii solen batre en fase per a impulsar la fase cap endavant. L’origen físic d’aquestes coordinacions no es coneix del tot. Les ones metacròniques semblen ser d’origen hidrodinàmic, igual que per als flagels pertanyents a diferents cèl·lules somàtiques en Volvox carteri. No obstant això, els cossos basals – ancoratges flagel·lars al cos cel·lular – semblen determinar el pla de batecs en Tetrahymena, mentre que les xarxes citoplasmàtiques d’actina i microtúbuls que interactuen amb els cossos basals són necessàries per a la metacronia en les cèl·lules ciliades embrionàries de Xenopus. A nivell unicel·lular, Chlamydomonas pot bloquejar-se en fase mitjançant un flux extern molt més fort que el típic flux generat pel flagel. Per contra, els mutants cel·lulars que manquen de fibres estriades que connectin els cossos basals no mostren sincronització, la qual cosa indica que l’acoblament intracel·lular és necessari i que l’acoblament hidrodinàmic no és suficient per a la sincronització dels flagels d’una mateixa cèl·lula. Aquí utilitzem l’organisme model Chlamydomonas reinhardtii per a abordar aquestes qüestions. En la primera part, desenvolupem un experiment nou que fa desaparèixer l’acoblament hidrodinàmic interflagelar amb efectes hidrodinàmics mínims. Aquesta configuració ens permet sondejar l’efecte de l’acoblament mecànic intracel·lular per si sol en la sincronització. Els resultats mostren que l’acoblament intern és suficient per a la sincronia In-Phase, mentre que l’acoblament hidrodinàmic és necessari per a la sincronia Anti-Phase, mostrada de manera natural pel mutant de dominància flagel·lar ptx1. Aquests resultats llancen llum sobre l’estructura matemàtica del procés de sincronització en aquestes cèl·lules, en particular sobre l’origen del soroll en la dinàmica interflagelar, i el seu paper potencial en el mecanisme de canvi de marxa. En la segona part, desenvolupem un model que té en compte els nostres coneixements actuals sobre les propietats viscoelàstiques dels flagels, en particular els graus de llibertat basals i la dissipació interna. Per a inferir les propietats mecàniques estàtiques i dinàmiques, s’inclou un flux de fons dependent del temps. A continuació, presentem un mètode d’inferència basat en un enfocament de reducció de models. Hem demostrat que aquest enfocament permet inferir escales de temps internes del sistema, i ho provem experimentalment en cèl·lules de Chlamydomonas passivades, subjectes per una pipeta i sotmeses a un flux extern dependent del temps impulsat per una platina piezoelèctrica. En conjunt, aquests resultats aprofundeixen la nostra comprensió de les propietats mecàniques i la sincronització dels flagels, i mostren el paper crucial de les propietats mecàniques dels cossos basals, tal vegada impulsades biològicament, per a la coordinació del batec flagel·lar i entre flagels.