Estabilitat conformacional de variants de la ribonucleasa A: pressió i temperatura com a inductors dels desplegament proteic

Abstract

A fi d'analitzar la contribució de la regió C-terminal proposada com a iniciadora del plegament (CFIS 106-118) a l'estabilitat de l'RNasa A, els residus alifàtics d'aquesta regió es van substituir, mitjançant mutagènesi dirigida, per altres residus en els quals la cadena lateral alifàtica era rogressivament escurçada. La major part de les substitucions projectades suposaven delecions no disruptives de grups metil(è). A més, es va reemplaçar la Tyr115 per un Trp, de manera que, potencialment, s'introduïa una única sonda fluorescent, no desestabilitzant, per tal de seguir els canvis conformacionals que es poguessin generar en la regió durant el procés de legament/desplegament de la proteïna. Tant els paràmetres cinètics, com els espectres d'FTIR i CD, determinats per cadascuna de les ribonucleases variants, indiquen que els reemplaçaments aminoacídics efectuats presenten, en general, poc o cap efecte en l'estructura nativa i en l'activitat de l'enzim. Es va emprar l'espectroscòpia d'absorció a l'ultraviolat de quarta derivada, la fluorescència (per la variant amb Trp) i l'espectroscòpia d'infraroig per transformada de Fourier, per tal de seguir i caracteritzar, en condicions d'equilibri, les transicions conformacionals de cada variant en funció de la pressió i de la temperatura. Els resultats es van comparar amb els que es van obtenir per la proteïna salvatge. Per determinar més a fons les característiques del procés de desplegament de la variant Y115W, les transicions de desnaturalització induïdes per urea d'aquesta variant i de la proteïna salvatge, van ésser examinades per mitjà d'electroforesi en gradient d'urea i espectroscòpia de fluorescència. Curiosament, els canvis conformacionals que resulten de la desnaturalització per pressió són molt semblants als que s'obtenen per temperatura. Enfront d'un augment gradual tant de pressió com de temperatura, l'estructura terciària i els elements d'estructura secundària de les proteïnes estudiades es perden de manera conjunta i reversible. Aquestes variacions estructurals que es promouen descriuen un procés de desplegament molt cooperatiu i en dos estats. Atès que ambdues tècniques (UV i FTIR) utilitzen cadascuna un règim de concentració proteica molt diferent, els resultats indiquen que el procés de desplegament per pressió i per temperatura és intramolecular. Els resultats obtinguts suggereixen que la hidrofobicitat i el volum de les cadenes laterals del CFIS, juntament amb les interaccions de van der Waals entre elements d'estructura secundària intervenen de manera molt notable en l'estabilització de la proteïna. Entre els diferents aminoàcids alifàtics que pertanyen al CFIS C-terminal, la Val108 és el residu més important per tal de preservar la integritat estructural de l'estat natiu. Els reemplaçaments en aquesta posició causen petites alteracions conformacionals i una gran desestabilització de la proteïna (per exemple, el punt mig de la transició de desnaturalització per pressió i per temperatura de la variant V108G disminueix uns 592 MPa i 25ºC, respectivament, respecte a la proteïna salvatge). D'acord amb els resultats obtinguts, la variant Y115W ofereix una sonda útil per tal de seguir la cinètica de plegament/desplegament de l'RNasa A.

Para analizar la contribución de la región C-terminal propuesta como iniciadora del plegamiento (CFIS 106-118) en la estabilidad de la RNasa A, los residuos alifáticos de esta región fueron sustituidos, mediante mutagénesis dirigida, por otros residuos en los cuales la cadena lateral alifática era progresivamente recortada. La mayor parte de las sustituciones proyectadas suponían deleciones no disruptivas de grupos metilo(eno). Además, se reemplazó la Tyr115 por un Trp, de forma que, potencialmente, se introducía una única sonda fluorescente, no desestabilizadora, para seguir los cambios conformacionales que se pudieran generar en la región durante el proceso de plegamiento/desplegamiento de la proteína. Tanto los parámetros cinéticos, como los espectros de FTIR y CD, determinados para cada una de las ribonucleasas variantes, indican que las sustituciones aminoacídicas efectuadas presentan, en general, poco o ningún efecto en la estructura nativa y en la actividad de la enzima. Se utilizó la espectroscopia de absorción ultravioleta de cuarta derivada, la fluorescencia (para la variante con Trp) y la espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier, para seguir y caracterizar, en condiciones de equilibrio, las transiciones conformacionales de cada variante en función de la presión y de la temperatura. Los resultados se compararon con los que se obtuvieron por la proteína salvaje. Para determinar más a fondo las características del proceso de desplegamiento de la variante Y115W, las transiciones de desnaturalización inducidas por urea de esta variante y de la proteína salvaje, fueron examinadas mediante electroforesis en gradiente de urea y espectroscopia de fluorescencia. Curiosamente, los cambios conformacionales que resultan de la desnaturalización por presión son muy parecidas a los que se obtuvieron por temperatura. Enfrente de un aumento gradual tanto de presión como de temperatura, la estructura terciaria i los elementos de estructura secundaria de las proteínas estudiadas se pierden de forma conjunta y reversible. Estas variaciones estructurales que se promueven describen un proceso de desplegamiento muy cooperativo y en dos estados. Dado que las dos técnicas (UV y FTIR) utilizan cada una un régimen de concentración proteica muy diferente, los resultados indican que el proceso de desplegamiento por presión y por temperatura es intramolecular. Los resultados obtenidos sugieren que la hidrofobicidad y el volumen de las cadenas laterales del CFIS, junto con las interacciones de van der Waals entre elementos de estructura secundaria intervienen de forma muy notable en la estabilización de la proteína. Entre los diferentes aminoácidos alifáticos que pertenecen al CFIS C-terminal, la Val108 es el residuo más importante para preservar la integridad estructural del estado nativo. Las sustituciones en esta posición causan pequeñas alteraciones conformacionales y una gran desestabilización de la proteína (por ejemplo, el punto medio de la transición de desnaturalización por presión y por temperatura de la variante V108G disminuye unos 592 MPa y 25ºC, respectivamente, respecto a la proteína salvaje). De acuerdo con los resultados obtenidos, la variante Y115W ofrece una sonda útil para seguir la cinética de plegamiento/desplegamiento de la RNasa A.

To analyze the contribution of the postulated carboxy terminal chain-folding initiation site (CFIS 106-118) on ribonuclease A stability, the aliphatic side chains in this region were progressively truncated using site-directed mutagenesis. Most amino acid substitutions were designed to be non-disruptive deletions of methyl and methylene groups. In addition, replacement of Tyr 115 with Trp was designed for its potential as a unique and non-destabilizing fluorescent label of conformational changes local to the region. Steady-state kinetic parameters for the enzyme reaction, FTIR and CD spectra of each RNase A variant indicate that amino acid replacements performed in this region have, in general, little or no effect on the native structure and function of the enzyme. Fourth derivative UV absorbance, fluorescence (for the Trp variant) and Fourier transform infrared spectroscopy were used to detect and characterize the conformational transitions of each variant, as a function of both pressure and temperature. The results were compared with those presented for the wild-type protein. To further determine the unfolding properties of the Y115W variant, the unfolding transitions induced by urea of RNase A wild-type and Y115W variant, were examined by urea gradient gel electrophoresis and fluorescence spectroscopy. Interestingly, conformational changes resulting from pressure denaturation do not differ considerably from those obtained during temperature treatment. Simple two- state, reversible unfolding transitions were observed, suggesting that the disruption of tertiary and secondary structure of each protein at high pressure or temperature is strongly cooperative. Spectral changes occur at about the same values using both low- and high-protein concentration regime techniques, indicating that the observed unfolding events are intramolecular, and that breakdown of the tertiary and secondary structures occurs concomitantly. The results obtained reveal that hydrophobicity and volume of the CFIS side chains, together with van der Waals interactions between secondary structural elements play an important role in stabilizing the protein. Among the aliphatic amino acids belonging to the C-terminal CFIS, V108 is the most critical residue. Replacements performed in this site cause small conformational differences in the native state, and a dramatic destabilization of the protein (i.e. the pressure and temperature midpoint denaturation values of the V108G variant decrease by 592 MPa and by 25ºC, respectively, relative to the wild-type RNase A). According to the results obtained in the current study, the Y115W labeled variant offers a useful probe for the folding/unfolding kinetics.