A practical approach on boar sperm cryodamage. Morphofunctional and immunocytochemical study of cryopreserved boar sperm intended for use in artificial insemination

Abstract

L'ús d'esperma criopreservada en la inseminació artificial (IA) d'espècies d'interès productiu permet un major control sanitari i la creació de bancs de germoplasma d'alt valor genètic, entre d'altres avantatges. En el mercat porcí la major part de les inseminacions són encara realitzades amb semen refrigerat degut a l'èxit de l'aplicació de diluents de llarga durada i també a causa de la sensibilitat de l'esperma porcina a la criopreservació. Malgrat que aquesta sensibilitat ve donada per característiques particulars de la fisiologia espermàtica en l'espècie, algunes ejaculacions mantenen els paràmetres de qualitat espermàtica després de la criopreservació (ejaculacions amb bona "congelabilitat", GFEs) enfront d'altres que no sobreviuen al procés (ejaculacions amb mala "congelabilitat", PFEs). El primer objectiu de l'estudi va ser comparar ambdós grups en termes de fertilitat in vivo. El segon objectiu va ser testar l'eficiència de la inseminació postcervical (post-CAI) amb l'esperma criopreservada. El tercer objectiu va ser buscar predictors de la congelabilitat de les ejaculacions, tant en les GFEs com en les PFEs i en tres passos del procés de criopreservació (a 17ºC, a 5ºC i a 240 min postdescongelació). Aquest objectiu es va dur a terme mitjançant l'avaluació de paràmetres convencionals de qualitat espermàtica i a través de l'estudi de la localització i la reactivitat sota el microscopi de tres proteïnes (GLUT3, HSP90AA1 i Cu/ZnSOD) relacionades amb la fisiologia espermàtica i amb possibles rols en la congelabilitat. El quart objectiu va ser quantificar l'expressió de les tres proteïnes per transferència western, tant en espermatozoides d'ejaculacions GFEs com en els d'ejaculacions PFEs i en els tres passos abans esmentats, per tal de determinar el seu potencial com a predictores de la congelabilitat. Pel primer i el segon objectiu, 86 truges van ser inseminades per post-CAI amb 26 ejaculacions de mascles Piétrain dividides en una porció refrigerada a 17ºC (tractament control) i una porció criopreservada, ambdues porcions classificades alhora com a GFEs o PFEs. Els resultats més rellevants van demostrar que les probabilitats d'embaràs eren dues vegades menors en inseminacions amb esperma criopreservada d'ejaculacions PFEs (P < 0.05) que en inseminacions amb esperma criopreservada d'ejaculacions GFEs, fet que indica que les ejaculacions amb percentatges elevats d'espermatozoides mòbils progressius i d'integritat de membrana (per sobre del 40% en les GFEs) són més favorables a provocar embarassos que no pas aquelles ejaculacions amb una pobra funció espermàtica in vitro (PFEs). Ni el nombre de truges que van donar a llum, ni la quantitat de garrins, ni el risc de reflux espermàtic van ser significativament diferents entre les inseminacions amb esperma criopreservada d'ejaculacions GFEs i les inseminacions control amb semen refrigerat, la qual cosa demostra la bona aplicabilitat de la inseminació post-CAI amb l'esperma criopreservada. Finalment, pel tercer i quart objectius van ser criopreservades 29 i 11 ejaculacions de mascles Piétrain, respectivament. Dos paràmetres cinètics espermàtics, la linealitat (LIN) i la rectitud (STR), van mostrar una hiperactivació de la mobilitat superior en les ejaculacions PFEs que en les GFEs després de 30 min a 5ºC durant la criopreservació. A més, la combinació d'ambdós paràmetres va donar una fiabilitat propera al 72% en la predicció de la congelabilitat de les ejaculacions porcines. Tot i que no va ser possible predir la congelabilitat mitjançant l'avaluació de les tres proteïnes al microscopi, els resultats de transferència western van revelar diferències en l'expressió de la HSP90AA1 en l'esperma a 17ºC, molt possiblement relacionades amb la millor supervivència a la criopreservació dels espermatozoides d'ejaculacions GFEs. Aquests resultats suggereixen que la promoció de la criopreservació d'esperma porcina per la seva aplicació en IA passa pel desenvolupament de tests per la predicció de la congelabilitat en semen refrigerat.

The use of frozen-thawed (FT) sperm in artificial insemination (AI) of species with productive interest allows higher sanitary control and the creation of high genetic value sperm banks, among other advantages. In the swine market, most inseminations are still performed with refrigerated semen (FS) because of the successful application of long-term extenders and the sensitivity of boar sperm to cryopreservation. Although this sensitivity is provided by particular features of the sperm physiology in boars, some boar ejaculates maintain the sperm quality parameters after freezing (good freezability ejaculates, GFEs) in front of others that do not survive the process (poor freezability ejaculates, PFEs). The first objective of the study was to compare both groups in terms of field fertility. The second objective was to test the efficiency of the post-cervical AI (post-CAI) with FT sperm. The third objective was to search for predictors of the ejaculate freezability by assessing, both in GFEs and in PFEs and in three steps during the cryopreservation procedure (17ºC, 5ºC and 240 min post-thaw), conventional sperm quality parameters and the location and reactivity, under the microscope, of three proteins related to the sperm physiology with potential roles in freezability (GLUT3, HSP90AA1 and Cu/ZnSOD). The fourth objective was to quantify, through western blotting, the expression of the three proteins, both in GFEs and in PFEs and in the three steps mentioned, to determine their potential as freezability predictors. For the first and second objectives, 86 sows were inseminated by post-CAI with 26 ejaculates from Piétrain boars divided into a 17ºC FS portion (control treatment) and a cryopreserved (FT) sperm portion, the two portions in turn classified into GFEs and PFEs. The most relevant outcomes were that the probabilities of pregnancy resulted two times lower after inseminations with FT-PFEs (P < 0.05) compared to FT-GFEs, which indicates that ejaculates with high post-thaw sperm progressive motility and membrane integrity (over 40% in GFEs) are more likely to result in pregnancies than those with poor in vitro sperm function (PFEs). Neither the number of farrowing sows and the litter size nor the risk of sperm backflow was significantly different in FT-GFEs from that achieved in FS control treatments, which showed the good applicability of post-CAI to boar FT sperm. For the third and fourth objectives, 29 and 11 Piétrain boar ejaculates, respectively, were cryopreserved. Two kinematic indices, the sperm linearity (LIN) and the sperm straightness (STR), revealed higher hyperactivated motility in PFEs than in GFEs when assessed after 30 min at 5ºC during cryopreservation, the combination of the two motility parameters showing around 72% confidence in the freezability prediction of ejaculates. Whereas it was not possible to predict the freezability of the boar ejaculates by assessing the three proteins under microscope, results from western blot showed differences in the HSP90AA1 expression in sperm at 17ºC that are most possibly related to the best cryosurvival of GFEs. This finding aims to promote the cryopreservation of boar sperm intended for use in AI through the development of tests for freezability prediction in FS.