Factors sèrics en l’Esclerosi Lateral Amiotròfica. Modulació del receptor de glutamat de tipus NMDA GluN1/GluN2A

Abstract

L’Esclerosi Lateral Amiotròfica (ELA o ALS) és una malaltia neuromuscular caracteritzada per la degeneració selectiva de les motoneurones (MN) superiors e inferiors del còrtex motor, el tronc de l’encèfal i la medul•la espinal, que resulta en una debilitat, espasticitat i atròfia progressives de la musculatura. Menys del 10% dels casos corresponen a la forma familiar de la malaltia, i un 20% d’aquests estan relacionats a mutacions en el gen de l’enzim superòxid dismutasa 1 (mSOD1). La resta de casos corresponen a la forma esporàdica. Les causes implicades en la degeneració selectiva de les MN en la ELA són encara desconegudes. La seva patogènesi s’ha atribuït a diversos mecanismes com serien l’estrès oxidatiu, l’agregació proteica anormal, la disfunció mitocondrial, el transport axonal aberrant, la neuroinflamació, l’autoimmunitat o l’excitotoxicitat per glutamat. En el present estudi hem treballat amb dues d’aquestes hipòtesis en avaluar l’efecte dels sèrums de pacients amb ELA i altres malalties de la MN sobre l’activitat del receptor ionotròpic de glutamat de tipus N-metil-D-Aspartat (NMDAR), expressat en el model d’oòcit de Xenopus laevis. Mitjançant assaigs de ELISA hem analitzat la presència d’autoanticossos associats a ELA en el sèrum de pacients. L’acció dels sèrums control i patològics en els oòcits de Xenopus produïa la generació de corrents oscil•latoris de clorur (Cl-). Aquests corrents havien estat prèviament descrits en aquestes cèl•lules i són deguts a l’activació dels canals de Cl- dependents de calci (Ca2+), endògens en els oòcits de Xenopus, a causa de la mobilització de Ca2+ intracel•lular. L’alliberació de Ca2+ dels compartiments intracel•lulars es activada per l’acció d’un factor sèric, anomenat àcid lisofosfatídic o lisofosfatidat (LPA), sobre el seu receptor, present en la membrana dels oòcits, i a través d’una via de senyalització de segons missatgers. Així doncs, en aquest model, la generació de corrents oscil•latoris de Cl- és una mesura indirecta de la mobilització intracel•lular de Ca2+. En presència del NMDAR, les respostes generades pel sèrum ELA eren significativament superiors a les activades pel sèrum d’individus sans i d’altres malalties de la MN. La resposta generada pel sèrum ELA presentava una dependència respecte de la presència de les dues subunitats del NMDAR i era sensible al bloqueig del receptor amb MK-801, un antagonista no competitiu. Vàrem reproduir els experiments amb sèrums del model de rata transgènica mSOD1 G93A, considerat un model de la forma familiar de la malaltia. Les mostres de sèrum mSOD1 G93A generaven, en presència del NMDAR, respostes significativament superiors a les activades pel sèrum de rata WT. En analitzar l’acció de la fracció de IgG purificada dels sèrums control i patològics en el model d’oòcit de Xenopus, es generaven corrents transitoris d’entrada de tipus no oscil•latori, els quals diferien dels generats en el cas del sèrum complet. La resposta activada per IgG de pacients amb ELA en presència del NMDAR era també significativament superior a la generada per les IgG d’individus sans. En la segona part d’aquest estudi s’ha comprovat la presència d’anticossos contra la proteïna Semaforina 3A (Sema3A) en alguns sèrums de ELA i Lower Motor Neuron Disease (LMND), una altra forma comuna de malaltia de la MN. La Sema3A és una molècula quimiotàctica de guia axonal recentment relacionada amb la patologia de la ELA en detectar-se una sobreexpressió d’aquesta proteïna en cèl•lules de Schwann terminals del model de ratolí mSOD1 G93A. Tot i descartar-se que els anticossos contra Sema3A siguin un marcador específic de la ELA, al no detectar-se en tots el sèrums de pacients, i alhora, al estar presents també en algunes mostres LMND, aquests autoanticossos podrien tenir un efecte defensiu contra les senyals nocives exercides per Sema3A sobre els axons de les MN.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a devastating neuromuscular disease, characterized by the selective degeneration of the superior motor neurons in the motor cortex and of the inferior motor neurons in the brain-stem and spinal cord. The familial form of the illness is associated with the mutation of the superoxide dismutase enzyme (SOD-1). This and other mutations accounts for fewer than 10% of cases; the rest, more than 90%, correspond to the sporadic form. In this study we tested the effect of sera from sporadic ALS patients and from mutated human SOD-1 (mSOD1 G93A) transgenic rats on N-methyl-D-aspartate receptors (NMDAR). We hypothesize that an endogenous excitotoxic factor is implicated in neuronal death in ALS, mediated by the activation of NMDAR noncanonical signalling pathways. Sera from ALS patients or healthy subjects were pretreated to inactivate complement pathways and dialysed to remove glutamate. Sera from mSOD1 G93A rats were obtained at different stages of the neurodegenerative progression. Sera from transgenic rats were also pretreated to eliminate complement system and glutamate. Immunoglobulins G (IgGs) from ALS patients and healthy subjects were obtained by affinity chromatography and dialyzed against phosphate-buffered saline. Human NMDAR were expressed in Xenopus laevis oocytes, and glutamate-induced currents were recorded using the two electrode voltage clamp technique. We observed that sera from sporadic ALS patients induced transient oscillatory currents in Xenopus oocytes expressing NMDAR with a total electric charge significantly higher than the electric charge carried by currents induced by sera from healthy subjects. The currents were inhibited by MK-801, a noncompetitive blocker of NMDAR. Results of sera from mSOD1 G93A transgenic rats were similar to those of sera from ALS patients; samples from patients with another type of neuromuscular disease did not exert this effect. IgG from ALS patients have a significant effect on NMDAR-injected oocytes and that response was doubled respect to the observed in the case of IgG from healthy subjects. Our data agree with the view that ALS patients sera contain some soluble factors that activates NMDAR, not opening directly the ionic conductance, but activating a non-canonical pathway.