Caracterización y análisis funcional de una familia de glutaredoxinas monotiólicas en la levadura

Abstract

Les glutaredoxines són enzims que intervenen en reaccions redox i que la seva<br/>funció principal consisteix en protegir les cèl·lules contra estrès oxidatiu mitjançant el<br/>manteniment de l'estat redox adequat dels grups sulfidril de les proteïnes cel·lulars.<br/>Treballs anteriors han descrit l'existència de dues glutaredoxines en el llevat<br/>Saccharomyces cerevisiae, Grx1 i Grx2, que contenen dues cisteïnes en el seu centre<br/>actiu les quals són essencials per a mantenir la seva funció. Aquestes dues<br/>glutaredoxines juguen diferents papers en la cèl·lula en la protecció contra estrès<br/>oxidatiu.<br/>Aquest treball consisteix en l'estudi i caracterització d'una nova família de<br/>glutaredoxines en S. cerevisiae, formada per Grx3, Grx4 i Grx5, que es diferencia de la<br/>ja descrita perquè les proteïnes tenen una única cisteina en el seu centre actiu. S'ha<br/>realitzat un anàlisi comparatiu de les seqüències de les dues famílies de glutaredoxines<br/>de llevat amb les existents en altres organismes, i s'ha vist que l'estructura bàsica de les<br/>mateixes està conservada des de bacteris a humans. L'anàlisi funcional dels mutants<br/>d'aquesta nova família ha revelat que, de les tres glutaredoxines monotiòliques, Grx5 és<br/>la que desenvolupa una funció més important en la protecció contra estrès oxidatiu,<br/>clarament diferenciada de Grx3 i Grx4. Grx5 s'ha vist localitzada en la mitocòndria,<br/>essent aquesta localització indispensable per al normal funcionament de l'enzim. Grx3 i<br/>Grx4, en canvi, es troben al nucli. D'acord amb la sublocalització cel·lular, es mostren<br/>diferents evidències de què Grx5 es troba directament implicada en la biosíntesi dels<br/>centres Fe/S, que en llevats té lloc a la mitocòndria. Els mutants mancats de Grx5 són<br/>defectuosos en l'activitat d'enzims amb centres Fe/S i acumulen en excés de ferro, tant<br/>al citosol com a la mitocòndria. Estudis mitjançant la tècnica del doble-híbrid han<br/>demostrat una interacció física entre Grx5 i Isa1, una altra proteïna de la matriu<br/>mitocondrial que intervé en la síntesi dels centres Fe/S. Les dades existents indiquen<br/>que les glutaredoxines monotiòliques poden portar a terme funcions especialitzades<br/>cada una d'elles en diferents compartiments del llevat, sense excloure la possible<br/>redundància funcional entre Grx3 i Grx4.

Las glutaredoxinas son enzimas que intervienen en reacciones redox y cuya<br/>función principal consiste en proteger las células contra estrés oxidativo a través del<br/>mantenimiento del estado redox adecuado de los grupos sulfidrilo de las proteínas<br/>celulares. Trabajos anteriores han descrito la existencia de dos glutaredoxinas en la<br/>levadura Saccharomyces cerevisiae, Grx1 y Grx2, que contienen dos cisteínas en su<br/>centro activo las cuales son esenciales para mantener su función. Estas dos<br/>glutaredoxinas juegan diferentes papeles en la célula en la protección contra estrés<br/>oxidativo.<br/>El presente trabajo consiste en el estudio y caracterización de una nueva familia<br/>de glutaredoxinas en S. cerevisiae, formada por Grx3, Grx4 y Grx5, que se diferencia de<br/>la ya descrita porque las proteínas poseen una única cisteína en su centro activo. Se ha<br/>realizado un análisis comparativo de las secuencias de las dos familias de<br/>glutaredoxinas de levadura con las existentes en otros organismos, observándose que la<br/>estructura básica de las mismas está conservada desde bacterias a humanos. El análisis<br/>funcional de los mutantes de esta nueva familia ha revelado que, de las tres<br/>glutaredoxinas monotiólicas, Grx5 es la que desarrolla una función más importante en la<br/>protección contra estrés oxidativo, claramente diferenciada de Grx3 y Grx4. Grx5 se ha<br/>visto localizada en la mitocondria, siendo esta localización indispensable para el normal<br/>funcionamiento de la enzima. Grx3 y Grx4, en cambio, se encuentran en el núcleo. En<br/>concordancia con la sublocalización celular, se muestran varias evidencias de que Grx5<br/>se halla directamente implicada en la biosíntesis de los centros Fe/S, que en levaduras<br/>tiene lugar en la mitocondria. Los mutantes carentes de Grx5 son defectivos en la<br/>actividad de enzimas con centros Fe/S y acumulan un exceso de hierro, tanto en el<br/>citosol como en la mitocondria. Estudios mediante la técnica del doble-híbrido han<br/>demostrado una interacción física entre Grx5 e Isa1, otra proteína de la matriz<br/>mitocondrial que interviene en la síntesis de centros Fe/S. Los datos existentes apuntan<br/>a que las glutaredoxinas monotiólicas pueden desempeñar funciones especializadas cada<br/>una de ellas en compartimentos diversos de la levadura, sin excluir la posible<br/>redundancia funcional entre Grx3 y Grx4.

Glutaredoxins are enzymes involved in redox reactions, whose main function<br/>consists of protecting cells against oxidative stress through maintaining a normal redox<br/>status of sulfhydril groups in cellular proteins. Previous work has described two<br/>glutaredoxins in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Grx1 and Grx2, that contain two<br/>cysteines residues in their active site, which are essential for their enzymatic function.<br/>These two glutaredoxins play different roles in protecting cells against oxidative stress.<br/>The present work consists of the study and characterisation of a new family of<br/>glutaredoxins in S. cerevisiae, composed by Grx3, Grx4 and Grx5. These have a single<br/>cysteine in the active site of the protein, in contrast to the previous glutaredoxins. A<br/>comparative analysis of the sequences of the two families of the yeast glutaredoxins<br/>and the glutaredoxins of other organisms has been carried out, and the basic structure of<br/>these enzymes is indeed conserved from bacteria to humans. The functional analysis of<br/>mutants of this new family reveals that Grx5 is the most important monothiolic<br/>glutaredoxin in protecting cells against oxidative stress, and that its function is different<br/>from that of Grx3 and Grx4. Grx5 is located in mitochondria and this localisation is<br/>needed for the normal function of the enzyme. In contrast, Grx3 and Grx4 are located at<br/>the nucleus. According to the subcellular location, several evidences are shown<br/>demonstrating that Grx5 is directly involved in the biosynthesis of Fe/S clusters, which<br/>takes place at the mitochondrial matrix in yeast. The grx5 mutants are defective in the<br/>activity of Fe/S enzymes and accumulate iron both in mitochondria and cytosol. Twohybrid<br/>assays show that there is a physical interaction between Grx5 and Isa1, another<br/>matrix mitochondrial protein that participates in the synthesis of Fe/S clusters. All these<br/>data suggest that monothiolic glutaredoxins play specialised functions in different<br/>compartments of yeast, which does not exclude the possibility that Grx3 and Grx4 could<br/>be functionally redundant.