Las glutaredoxinas monotiólicas como reguladoras redox de proteínas: estudios funcionales y evolutivos en Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Les glutaredoxines són tiol oxidoreductases que regulen l'estat redox dels grups sulfidril de les proteïnes. Al llevat Saccharomyces cerevisiae Grx1 i Grx2 són glutaredoxines ditiòliques localitzades al citosol, mentres que Grx3, Grx4 i Grx5 són monotiòliques. Grx5 es localitza a la matriu mitocondrial i participa en la síntesi de centres ferro/sofre (Fe/S). Quan és absent, enzims amb centres Fe/S com l'aconitasa són inactives, no hi ha creixement en condicions respiratòries, hi ha acumulació de ferro intracel.lular i es produeix una oxidació constitutiva de proteïnes. Grx5 conté un domini tioredoxina simple. En canvi, Grx3 i Grx4 posseeixen un domini de tipus tioredoxina unit al domini glutaredoxina. Aquestes darreres dues proteïnes es localitzen al nucli, éssent el domini tioredoxina necessari per aquesta localització. S'ha utilitzat el mutant nul grx5 com model de cèl·lules que manifesten un estrés oxidatiu endògen constitutiu (oposat a les situacions on l'estrés és provocat per un estímul extern) per tal d'estudiar el transcriptoma cel·lular en les esmentades condicions. Així, s'ha observat que: (i) s'indueixen principalment gens del reguló Aft1 involucrats en la captació i utilització de ferro, i (ii) es reprimeix l'expressió de gens implicats en el metabolisme respiratori depenents del regulador Hap4. Aquest darrer efecte és suprimit per la sobreexpressió de HAP4, de manera que la inhibició del metabolisme respiratori en condicions moderadament oxidants podria constituir una resposta protectora per part de les cèl.lules del llevat. Utilitzant una construcció capaç d'internalitzar proteïnes a la mitocondria mitjançant la senyal de localització mitocondrial de Grx5, s'ha demostrat que les glutaredoxines ditiòliques de S. cerevisiae no poden rescatar els defectes d'un mutant grx5, mentres que les monotiòliques Grx3 i Grx4 sí que ho fan quan són adreçades a la matriu mitocondrial. Això demostra que les glutaredoxines ditiòliques són funcionalment divergents de les monotiòliques, però que aquestes darreres poden intercanviar les seues activitats biològiques entre elles quan s'eliminen les barreres dels compartiments cel.lulars. La conservació funcional entre glutaredoxines monotiòliques s'extén al llarg de l'escala evolutiva, ja que els defectes del mutant grx5 de S. cerevisiae són també suprimits per altres proteïnes de la mateixa família com són Grx4 de Escherichia coli, GrxC de Synechocystis sp. i les respectives proteïnes homòlogues de pollastre i de cèl.lules humanes.

Las glutaredoxinas son tiol oxidoreductasas que regulan el estado redox de los grupos sulfidrilo de las proteínas. En la levadura Saccharomyces cerevisiae Grx1 y Grx2 son glutaredoxinas ditiólicas localizadas en el citosol, mientras que Grx3, Grx4 y Grx5 son monotiólicas. Grx5 se localiza en la matriz mitocondrial y está involucrada en la síntesis de centros hierro/azufre (Fe/S). En su ausencia, enzimas con centros Fe/S como la aconitasa son inactivas, no hay crecimiento en condiciones respiratorias, hay acumulación de hierro intracelular y se produce una oxidación constitutiva de proteínas. Mientras que Grx5 contiene un dominio glutaredoxina simple, Grx3 y Grx4 poseen un domino tipo tioredoxina fusionado al dominio glutaredoxina. Estas dos últimas proteínas se localizan en el núcleo, siendo el dominio tioredoxina necesario para tal localización. Se ha utilizado el mutante nulo grx5 como modelo de células que manifiestan un estrés oxidativo endógeno constitutivo (opuesto a las situaciones de estrés provocadas por un estímulo externo) para estudiar el transcriptoma celular en dichas condiciones. Se ha observado que: (i) se inducen principalmente genes del regulón Aft1 involucrados en la captación y utilización de hierro, y (ii) se reprime la expresión de genes implicados en el metabolismo respiratorio dependientes del regulador Hap4. Este último efecto es suprimido por la sobreexpresión de HAP4, de modo que la inhibición del metabolismo respiratorio durante condiciones moderadamente oxidantes podría constituir una respuesta protectora por parte de las células de la levadura. Utilizando una construcción capaz de internalizar proteínas en la mitocondria gracias a la señal de localización mitocondrial de Grx5, se ha demostrado que las glutaredoxinas ditiólicas de S. cerevisiae no son capaces de rescatar los defectos de un mutante grx5, en tanto que las monotiólicas Grx3 y Grx4 sí lo hacen cuando son dirigidas a la matriz mitocondrial. Ello demuestra que las glutaredoxinas ditiólicas son funcionalmente divergentes de las monotiólicas, pero que estas últimas pueden intercambiar entre ellas sus actividades biológicas cuando se sobrepasan las barreras compartimentales. La conservación funcional entre glutaredoxinas monotiólicas se extiende a lo largo de toda la escala evolutiva, dado que los defectos del mutante grx5 de S. cerevisiae son también suprimidos por otras proteínas de la misma familia como son Grx4 de Escherichia coli, GrxC de Synechocystis sp. y las respectivas proteínas homólogas de pollo y de células humanas.

Monothiol glutaredoxins are thiol oxidoreductases that regulate the redox state of sulfhydryl groups in proteins. In the yeast Saccharomyces cerevisiae Grx1 and Grx2 are dithiol glutaredoxins located at the cytosol, while Grx3, Grx4 and Grx5 are monothiol ones. Grx5 is located at the mitochondrial matrix and is involved in the synthesis of iron/sulfur (Fe/S) centers. In its absence, enzymes with Fe/S centers such as aconitase are inactive, there is no growth in respiratory conditions, iron is accumulated inside the cells and a constitutive oxidation of proteins occurs. While Grx5 contains a single glutaredoxin domain, Grx3 and Grx4 have a thioredoxin type domain fused to the glutaredoxin domain. These two proteins are located at the nucleus, the thioredoxin domain being necessary for such location. The null grx5 mutant has been used as a model for cells that display constitutive endogenous oxidative stress (as opposed to situations where the stress is caused by external stimulus), in order to study the cell transcriptome in such conditions. Thus, it has been observed that: (i) there is a general induction of the Aft1 regulon genes involved in iron uptake and utilization, and (ii) there is a repression of genes required for respiratory metabolism that depend on the Hap4 regulator. This latter effect is suppressed by the overexpression of HAP4. It is proposed that inhibition of respiratory metabolism during moderately oxidative conditions would constitute a protective response by the yeast cells. By using a genetic construction that is able to internalize proteins into the mitochondria by means of the mitochondrial targeting sequence of Grx5, it has been demonstrated that the S. cerevisiae monothiol glutaredoxins are unable to rescue the defects of a grx5 mutant, while the monothiol ones Grx3 and Grx4 rescue such defects when internalized into the mitochondrial matrix. This fact demonstrates that dithiol glutaredoxins are functionally divergent from monothiol ones, but these latter can interchange their biological activities when the compartment barriers are surpassed. Functional conservation among monothiol glutaredoxins extends along the evolutive scale, since the defects of the grx5 mutant of S. cerevisiae are also suppressed by other proteins of the same family such as Grx4 of Escherichia coli, GrxC of Synechocystis sp. and the respective homologues of chicken and human cells.