Regulación de TrkA a través del dominio intracelular: efecto de la unión a calmodulina y de la tirosina 701

Abstract

TrkA es va descobrir com a un oncogén producte de la fusió del seu domini tirosina<br/>kinasa (TK) amb la tropomiosina. Posteriorment, va augmentar el seu interès en<br/>descobrir-se que la proteïna nativa constituïa el receptor del factor de creixement<br/>nerviós (NGF).<br/>Es coneixen bé els esdeveniments que tenen lloc a partir de la unió del lligand al<br/>receptor i que donen lloc a l'activació de les vies de senyalització de les MAPK y<br/>PI 3-K/Akt. Se sap que, in vivo, la internalització del receptor i el seu transport<br/>retrògrad també juguen un paper important per a l'efecte a llarg termini del NGF i<br/>que és un tret distintiu en relació a d'altres receptors de factors de creixement.<br/>L'activació del receptor també comporta un augment transitori de Ca2+<br/>intracel· lular. Per això ens vam plantejar l'estudi de la relació entre l'activació de<br/>TrkA i calmodulina (CaM), com a sensor dels nivells de Ca2+ intracel· lulars.<br/>En primer lloc vam observar una interacció directa i dependent de Ca2+ entre CaM i<br/>la meitat c-terminal del domini intracel· lular de TrkA. La primera part del treball se<br/>centra en caracteritzar aquesta interacció.<br/>Per veure l'efecte de la unió sobre Trk, vam utilitzar inhibidors de CaM. Aquests<br/>no impedeixen la fosforilació de TrkA induïda per NGF, però sí comporten la<br/>proteòlisi del receptor donant lloc a un fragment amb activitat tirosina kinasa<br/>constitutiva. Donada la ubiqüitat de CaM, i la seva importància en processos vitals<br/>per a la cél· lula, el segon objectiu ha consistit en buscar el lloc d'unió a CaM de<br/>TrkA per així poder obtenir una construcció de Trk on es perdés la unió a CaM.<br/>Basant-nos en diverses evidències, ens vam centrar en la caracterització d'una regió<br/>que conté una Tyr fosforilable (Y701) i que forma part d'un motiu<br/>d'internalització. L'última part del treball se centra en descriure les característiques<br/>d'aquesta Tyr i la seva funció, que més enllà de la relació amb CaM, pot constituir<br/>una fosforilació inhibitòria per l'activitat de Trk i un lloc de regulació negativa de<br/>la internalització.

TrkA se descubrió como un oncogén producto de la fusión de su dominio tirosina<br/>kinasa (TK) con la tropomiosina. Posteriormente, aumentó su interés tras<br/>descubrirse que la proteína nativa constituía el receptor del factor de crecimiento<br/>nervioso (NGF).<br/>Se conocen bien los acontecimientos que ocurren tras la unión del ligando al<br/>receptor y que dan lugar a la activación de las vías de señalización de las MAPK y<br/>PI 3-K/Akt. Se sabe que, in vivo, la internalización del receptor y su transporte<br/>retrógrado también juegan un papel importante para el efecto a largo plazo del<br/>NGF y que es una característica distintiva de otros receptores de factores de<br/>crecimiento.<br/>La activación del receptor también conlleva un aumento transitorio de Ca2+<br/>intracelular. Por ello nos planteamos estudiar la relación entre la activación de<br/>TrkA y calmodulina (CaM), como sensor de los niveles de Ca2+ intracelulares.<br/>En primer lugar observamos una interacción directa y Ca2+ dependiente entre CaM<br/>y la mitad c-terminal del dominio intracelular de TrkA. La primera parte del trabajo<br/>se centra en caracterizar esta interacción.<br/>Para ver el efecto de la unión sobre Trk, utilizamos inhibidores de CaM. Éstos no<br/>impiden la fosforilación de TrkA inducida por NGF, pero sí conllevan la proteolisis<br/>del receptor dando lugar a un fragmento con actividad tirosina kinasa constitutiva.<br/>Dada la ubicuidad de CaM y su importancia en procesos vitales para la célula, el<br/>segundo objetivo consistió en buscar el sitio de unión a CaM de TrkA, para así<br/>poder obtener una construcción de Trk en que se perdiera la unión a CaM.<br/>Basándonos en diversas evidencias, nos centramos en la caracterización de una<br/>región que contenía una Tyr fosforilable (Y701) y que además forma parte de un<br/>motivo de internalización. La última parte del trabajo se centra en describir las<br/>características de dicha Tyr y su función,que más allá de la relación con CaM,<br/>puede constituir una fosforilación inhibitoria para la actividad de Trk y un lugar de<br/>regulación negativa de su internalización.

TrkA was discovered as an oncogen, product of the fusion of its Tyrosine kinase<br/>domain with Tropomiosin. Later on, it was identified as the receptor for the Nerve<br/>growth factor (NGF).<br/>The first steps in Trk signaling after ligand binding are well understood. And also<br/>the pathways leading to MAPKs and PI3K-Akt activation. But receptor<br/>internalization and retrograde transport are also important for the long term<br/>signaling of TrkA, giving raise to a differential regulation of Trk receptors among<br/>other growth factor receptors.<br/>Receptor activation also induces an increase in intracellular calcium concentration.<br/>That's why we thought on studying the relationship between TrkA activation and<br/>calmodulin (CaM), as a prototypical calcium sensor.<br/>First we described a direct and calcium-dependent interaction between CaM and<br/>the c-terminal part of TrkA. The first part of this work consists on the<br/>characterization of this interaction.<br/>In order to check the effect of CaM binding on TrkA we used CaM inhibitors.<br/>NGF-induced TrkA fosforilation was not inhibited upon CaM inhibition, but Trk<br/>was cleaved, leading to constitutively active fragments. CaM is ubiquous and<br/>necessary for many cell processes, so the second objective has been to search for<br/>the CaM binding domain on TrkA in order to generate a TrkA mutant defective in<br/>CaM binding.<br/>We mutated a region containing a phosphorylatable Tyrosine Y701 that constitutes<br/>a trafficking motif, as the putative binding site of CaM. The last part of this project<br/>deals with the characterization of the mutants, and their effect even regardless of<br/>CaM binding. Its phosphorylation might inhibit Trk function, and the region<br/>constitutes a negative regulator of internalization.