Caracterización de los antagonistas del receptor de muerte CD95/FAS/APO-1, FAIM y Lifeguard en el sistema nervioso

Abstract

La apoptosis es un mecanismo fisiológico que contribuye a regular el número de células de un organismo de tal forma que aquéllas que realizan funciones transitorias, que están lesionadas, o en exceso, serán eliminadas. Éste es un proceso estrictamente regulado durante el desarrollo embrionario e íntimamente ligado con el inicio o progresión de determinadas patologías. Así pues, el exceso de apoptosis contribuye al desarrollo de enfermedades neurodegenerativas mientras que su defecto sería el origen de neoplasias. El principal regulador del proceso apoptótico es la activación de las caspasas, cisteína-proteasas con especificidad para residuos de aspartato. Los principales mecanismos que activan las caspasas son la salida de citocromo C de la mitocondria por una alteración de la función mitocondrial, y la activación de proteínas de membrana denominadas receptores de muerte (DRs, Death Receptors). Estos últimos han sido ampliamente caracterizados en el sistema inmune, mientras que en tejidos como el sistema nervioso sus funciones están en las fases iniciales de caracterización.<br/>El objetivo del presente trabajo es contribuir a esclarecer los mecanismos moleculares que regulan la actividad de estos receptores en el sistema nervioso, a través de la caracterización funcional de dos nuevas proteínas, FAIM y Lifeguard, propuestas inicialmente como antagonistas del receptor de muerte CD95/Fas/APO-1. Para ello se han usado las líneas celulares PC12 y SH-SY5Y, ampliamente utilizadas en modelos de diferenciación y muerte celular, junto con cultivos primarios de neuronas corticales y neuronas granulares de cerebelo.<br/>En la primera parte de este trabajo se describe la clonación del ortólogo de ratón de Lifeguard, y su caracterización como antagonista funcional de CD95 en el sistema nervioso. Hemos demostrado que su sobreexpresión es capaz de bloquear la muerte inducida por CD95 en el modelo del neuroblastoma humano SH-SY5Y así como en neuronas corticales murinas. También hemos comprobado que la disminución de sus niveles endógenos sensibiliza a las neuronas granulares y las corticales de ratón. Además, se ha constatado que su mecanismo molecular de acción depende de su localización exclusiva en microdominios de membrana llamados Lipid Rafts, donde puede interaccionar con CD95 e inhibir la activación de caspasas iniciadoras.<br/>De los resultados obtenidos en la segunda parte del trabajo se deduce que los niveles de la isoforma larga del antagonista FAIM, FAIML, específica del sistema nervioso, aumentan durante el desarrollo embrionario. Su máxima expresión es en los períodos del desarrollo en los que se modelan y ajustan las estructuras neurales que darán lugar al cerebro adulto. Funcionalmente, hemos demostrado que no participa en procesos de neuritogénesis (a diferencia de la isoforma corta de FAIM, FAIMS) y que no bloquea la muerte apoptótica inducida a través de estímulos mitocondriales. Sin embargo, FAIML es capaz de antagonizar la apoptosis inducida a través de los DRs CD95 y TNFR1. Los ensayos >con RNA de interferencia nos han permitido elucidar que FAIML es, al menos en parte, responsable del bloqueo de la actividad de caspasas iniciadoras activadas por DRs.<br/>Por tanto, este trabajo aporta claves sobre las bases moleculares que regulan la actividad de los DRs en el sistema nervioso y que pueden constituir una base para el desarrollo de estrategias terapéuticas en neuropatologías en las que los DRs participan de forma relevante.

Apoptosis is a physiological process by which the number of cells in metazoan organisms is regulated. Thus, cells with transient function, supranumerary cells or damaged ones are selectively eliminated by this process. Apoptosis is strictly regulated and recently it has been suggested that it could be involved in the pathogenesis of some nervous system diseases. In that sense, an excess of cell death could contribute to neurodegenerative disorders and, on the other hand, a defect could be one of the reasons for neoplasia development. The main regulator of apoptosis is the activation of caspases. These are cysteine-proteases which have cleavage specificity for aspartic residues. Caspases are activated by two main mechanisms: (1) release of citocrome C from altered mitochondria to the cytoplasm and (2) activation of membrane receptors called death receptors (DRs). These proteins have been widely characterized in the immune system, whereas in the nervous system their functions are at the initial stages of characterization.<br/>The present project is focussed on the characterization of two novel antagonists of the death receptor CD95/Fas/APO-1 which are specifically expressed in the nervous system, Lifeguard and FAIM. For this purpose PC12 and SH-SY5Y cell lines, widely used in models of differentiation and cell death, have been used along with primary cultures of cortical neurons and cerebellar granule neurons.<br/>Results obtained in the first part of this study allowed us to clone mouse Lifeguard, and describe its function as an antagonist of CD95 in the nervous system. We have demonstrated that its overexpression is able to block CD95 induced cell death in the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y, and in mouse embryonic cortical neurons. Furthermore, reduction of Lifeguard endogenous levels sensitizes both, mouse granular and cortical neurons to CD95 induced apoptosis. In addition, it has been stated that the molecular mechanism of action of Lifeguard depends on its exclusive location in plasma membrane microdomains called Lipid Rafts, where it can interact with CD95 and inhibit the activation of initiator caspases.<br/>In the second part of this study, our results demonstrate that the expression of the long form of the CD95 antagonist FAIM, FAIML, specific of the nervous system, increases during the embryonic development. It reaches maximum levels in the periods of the development in which the neural structures are being defined, thus creating adult brain structures.<br/>Functionally, we have demonstrated that FAIML, in contrast to the short form of FAIM (FAIMS), does not participate in neurotrophic factor induced neurite outgrowth and it is not able to block apoptotic induced cell death through mitochondrial stimuli. Nevertheless, FAIML is able to antagonize the apoptosis induced through DRs CD95 and TNFR1. FAIML RNA interference efficiently reduced its endogenous levels and allowed us to conclude that FAIML is one of the molecules responsible for maintaining initiator caspases inactive upon receptor engagement.<br/>Therefore, this work will contribute to the understanding of the molecular basis for DRs activity regulation in the nervous system, and it could constitute a starting point for the development of new therapeutic strategies for DRs associated neuropathologies.