Estudi del dany oxidatiu en proteïnes i efecte de la restricció calòrica en l'envelliment de saccharomyces cerevisiae

Abstract

S. cerevisiae és un organisme unicel·lular on s'hi han descrit dos tipus d'envelliment, el cronològic i el replicatiu. L'envelliment cronològic es defineix com la capacitat d'un cultiu de mantenir la seva viabilitat al llarg del temps i s'utilitza com a model senzill d'estudi d'envelliment en teixits post-mitítics. L'envelliment replicatiu es defineix com el nombre de cèl·lules filles que una cèl·lula mare verge pot generar al llarg de la seva vida i es utilitzat com a model d'estudi de l'envelliment en teixits mitíticament actius.<br/>La teoria de l'estrés oxidatiu aplicada a l'envelliment proposa que les espècies<br/>reactives de l'oxigen (ROS) provoquen un dany progressiu que afecta a DNA, lípids i<br/>proteïnes i que té com a resultat el deteriorament cel·lular que caracteritza l'envelliment. Entre les modificacions oxidatives que tenen lloc en proteïnes, la formació de grups carbonil és una de les més estudiades. Es tracta d'una alteració de<br/>l'estructura química de tipus irreversible i s'ha descrit que la seva presència augmenta<br/>amb l'edat en diversos tipus cel·lulars. En aquest treball s'ha utilitzat una aproximació<br/>proteímica per estudiar l'oxidació de les proteïnes del llevat durant l'envelliment. Com<br/>a marcador de dany oxidatiu s'ha utilitzat la formació de grups carbonil. Els resultats<br/>indiquen un increment progressiu de dany oxidatiu durant l'envelliment cronològic i replicatiu. En ambdós casos, aquest dany és previngut per la restricció calòrica, l'única intervenció coneguda capaç d'augmentar la longevitat en tots els organismes estudiats. A més, s'han identificat les principals dianes d'oxidació proteica en ambdós<br/>tipus d'envelliment que corresponen a proteïnes de resistència a estrés i proteïnes del<br/>metabolisme energètic. Per estudiar amb profunditat l'efecte del dany oxidatiu en<br/>l'envelliment s'han construït soques amb una còpia addicional de gens d'aquestes proteïnes, la qual cosa ha portat a identificar la soca 2xADH1 com més longeva.<br/>Adh1 és una alcohol deshidrogenasa que catalitza l'últim pas de la fermentació de la glucosa en llevat. En aquesta reacció la reducció de l'acetaldehid a etanol va ssociada a l'oxidació del NADH regenerant el coenzim NAD+. Sir2 és una histona desacetilasa dependent de NAD+ que juga un paper clau en la regulació de l'envelliment replicatiu del S. cerevisiae. Els resultats assenyalen que un augment de l'activitat Adh1 augmenta el rítio NAD+/NADH i l'activitat de Sir2 promovent l'increment de la longevitat replicativa. D'altra banda, l'augment d'expressió d'Adh1 genera un augment en la taxa de respiració mitocondrial i un augment de les ROS intracel·lulars que porta a la inducció de les defenses antioxidants. Aquest fet permet<br/>que la soca 2xADH1 sigui més resistent a un tractament amb H2O2 i presenti una<br/>major longevitat cronològica. Tant els fenòmens que incrementen la longevitat replicativa com la cronològica semblen estar connectats ja que s'ha vist que un tractament amb H2O2 indueix l'expressió de Sir2. A més, la deleció de SIR2 suprimeix les diferències de resistència a estrés. Aquestes dades fan pensar en una possible via<br/>d'inducció dels sistemes antioxidants on la proteïna nuclear Sir2 tingui un paper clau i<br/>d'altra banda posa en evidència el fet que el manteniment de l'activitat d'enzims que<br/>participen en l'equilibri NAD+/NADH afectarà l'envelliment replicatiu i el cronològic.

S. cerevisiae es un organismo unicelular en el que se han descrito dos tipos de envejecimiento, el cronológico y el replicativo. El envejecimiento cronológico se define como la capacidad de un cultivo de mantener su viabilidad a lo largo del tiempo. Por sus características es utilizado como modelo de estudio sencillo del envejecimiento en<br/>tejidos post-mitíticos. El envejecimiento replicativo se define como el número de<br/>células hijas que una célula madre virgen puede generar durante toda su vida. Por sus<br/>características se utiliza como modelo de estudio del envejecimiento en tejidos mitíticamente activos.<br/>La teoría del estréss oxidativo aplicada al envejecimiento propone que las especies<br/>reactivas del oxígeno (ROS) provocan un daño progresivo que afecta a DNA, lípidos y<br/>proteínas y que da como resultado el deterioro celular que caracteriza el envejecimiento. Entre las modificaciones oxidativas que tienen lugar en proteínas, la formación de grupo carbonilos es una de las más estudiadas. Se trata de una alteración de la estructura química de carácter irreversible y se ha descrito que su presencia aumenta con la edad en diferentes tipos celulares. En este trabajo se ha utilizado una aproximación proteímica para estudiar la oxidación de las proteínas en levadura durante el envejecimiento. Como marcador de daño oxidativo se ha utilizado<br/>la formación de grupos carbonilo. Los resultados indican un incremento progresivo del daño oxidativo durante el envejecimiento cronológico y replicativo. En los dos casos, este daño es evitado por la restricción calórica, la única intervención conocida capaz de aumentar la longevidad en todos los organismos estudiados. Además, en este estudio, se han identificado las principales dianas de oxidación proteica en los dos tipos de envejecimiento que se corresponden con proteínas de resistencia a estrés y<br/>proteínas del metabolismo energético. Para estudiar con profundidad el efecto del<br/>daño oxidativo en el envejecimiento se han construido cepas con una copia adicional<br/>de genes de estas proteínas. Esto ha permitido identificar a la cepa 2xADH1 como más<br/>longeva.<br/>Adh1 es una alcohol deshidrogenasa que cataliza el último paso de la fermentación de la glucosa en levadura. En esta reacción la reducción del acetaldehído a etanol va asociada a la oxidación del NADH regenerando el coenzima NAD+. Sir2 es una histona deacetilasa dependiente de NAD+ que desempeña un papel importante en la regulación del envejecimiento replicativo de S. cerevisiae. Los resultados muestran que un aumento de la actividad Adh1 promueve un aumento del ratio NAD+/NADH y<br/>de la actividad de Sir2. Esto de traduce en una mayor longevidad replicativa en la cepa 2xADH1. Por otro lado, aumento de expresión de Adh1 genera un incremento de la tasa de respiración mitocondrial y una mayor producción de ROS que induce las defensas antioxidantes. Este hecho permite que la cepa 2xADH1 sea más resistente a<br/>tratamiento con H2O2 y presente una mayor longevidad cronológica. Estos fenómenos que aumentan la longevidad replicativa y cronológica parecen estar conectados ya se ha visto que un tratamiento con H2O2 induce la expresión Sir2. Además, la deleción de SIR2 suprime las diferencias observadas en resistencia a estrés. Estos resultados hacen posible pensar en una posible vía de inducción de los sistemas antioxidantes donde la proteïna nuclear Sir2 juegue un papel clave. Además, en este trabajo<br/>también se pone en evidencia el hecho que el mantenimiento de la actividad de enzimas que participen en el equilibrio NAD+/NADH afectará al envejecimiento replicativo y cronológico.

In the yeast S. cerevisiae two aging processes has been described, chronological and replicative lifespan. Chronological lifespan refers to the ability of stationary cultures to maintain viability over time and has been used as a valuable model to study aging in post-mitotic tissues. Replicative lifespan is described as the number of daughter cells produced by each dividing mother cell and has been used as a useful<br/>model to study aging in mitotic tissues.<br/>The oxidative stress theory of aging states that reactive oxygen species (ROS) causes a progressive damage, afecting DNA, lipids and proteins, resulting in the functional decline that defines aging. Among the oxidative mofications afecting<br/>proteins, carbonylation is one of the most studied. This reaction has an irreversible<br/>nature and a large number of studies have shown that protein carbonylation increases<br/>with age. In this study, a proteomic approach has been used to study protein oxidation in yeast aging and carbonyl formation was selected as a marker of oxidative stress. In both, replicative and chronological lifespan, an increase in protein oxidative damage has been observed when compared old with young cells. In addition, calorie<br/>restriction, the only know intervention in grade to increase longevity in all the organisms studied, resulted in a decreased oxidative damage during yeast aging.<br/>Furthermore, the main protein targets of oxidative stress have been identified and common targets between the two aging models include stress resistance proteins and enzymes involved in glucose metabolism. To analyse the effect of oxidative damage to proteins in the aging process, several strains carrying an additional copy of the gene from these proteins were constructed. This fact leads to identification of 2xADH1 as a<br/>long-lived strain when compared to wild type.<br/>Adh1 is an alcohol dehydrogenase that catalyzes the conversion of acetaldehyde to ethanol in the last step of glycolisis. In this reaction, NADH is oxidazed to regenerate NAD+. In S. cerevisiae, Sir2 is a NAD+-dependent histone deacetylase that plays a key function in replicative lifespan. In the 2xADH1 strain an increase both in NAD+/NADH<br/>ratio and Sir2 activity were observed when compared to wild type. This agrees with<br/>the increased replicative lifespan observed. Moreover, Adh1 overexpression increases<br/>mitochondrial respiration rate and ROS production. This leads to an induction of several antioxidant genes promoting higher oxidative stress resistance and an increase in chronological lifespan in 2xADH1 cells. Interestingly, this two facts leading to an increased replicative and chronological aging seem to be connected because a H2O2 treatment induces Sir2 expression. In addition, SIR2 deletion abrogates the observed<br/>differences between wild type and 2xADH1 cells in stress resistance. All these data suggest a possible stress resistance pathway where Sir2 participates actively. In summary, it may be suggested that maintaining the activity of enzymes participating in NAD+/NADH balancing will affect chronological and replicative lifespan.