Modificaciones del proteoma en modelos celulares de Ataxia de Friedreich y su relación con el estrés oxidativo y la Homeostasis del hierro

Abstract

El ferro juga un paper essencial en el metabolisme a causa de la seva gran versatilitat com a catalitzador biològic. La seva acumulació, però ha estat associada amb diverses condicions patològiques com per exemple l'Ataxia de Friedreich. Aquesta malaltia humana està causada per la disminució de l'expressió d'una proteïna mitocondrial anomenada frataxina. Un gran nombre d'estudis utilitzant diferents models, relacionen frataxina amb el metabolisme de ferro, ja que la seva deficiència provoca la sobrecàrrega d'aquest metall. La funció precisa de la proteïna és motiu de controvèrsia. La majoria d'investigadors la consideren necessària per a la biosíntesi dels centres Fe-S ja que en la seva absència les activitats d'enzims amb aquest tipus de centres es troben disminuïdes. Molts dels estudis realitzats a fi de conèixer la funció de frataxina han estat duts a terme en el llevat Saccharomyces cerevisiae, ja que frataxina i el seu homòleg en llevat, YFH1, són ortólegs.<br/>Com a punt de partida d'aquesta tesi, ens plantejàrem l'estudi del proteoma del mutant &#916;yfh1en llevat com a model de l'Ataxia de Friedreich. L'estratègia utilitzada es va basar en l'ús d'electroforesi bidimensional i posterior identificació de proteïnes diferencialment expressades en mutants &#916;yfh1 mitjançant empremta de masses peptídiques. Aquest anàlisi proteòmic, ens va revelar que les esmentades cèl·lules presenten un increment en la quantitat de proteïnes involucrades en la resposta a estrès oxidatiu. Entre els enzims induïts trobem a les superòxid<br/>dismutases 1 i 2, que, tanmateix, van mostrar menor activitat que la trobada a les cèl·lules control. En el cas de la superòxid dismutasa dependent de manganès (Mn-SOD), aquest fet paradoxal era degut a una deficiència en aquest metall, ja que al suplementar el medi de cultiu amb manganès, van ser restaurats tant el seu contingut cel·lular com l'activitat Mn-SOD. Les activitats enzimàtiques de quatre proteïnes que contenen centres Fe-S van ser analitzades, abans i després de la suplementació del medi de cultiu amb manganès. Les activitats de tres d'elles van ser restaurades, el que indica que frataxina no és essencial per a la biosíntesi de centres Fe-S. La quarta proteïna analitzada, aconitasa, no recuperava la seva activitat.<br/>El segon objectiu va ser realitzar l'anàlisi del dany oxidatiu a proteïnes -també referit com a oxiproteoma- de les cèl·lules deficients en YFH1. La toxicitat del ferro està relacionada amb la seva capacitat per generar espècies reactives de l'oxigen (ROS), les quals tenen el potencial de danyar els components cel·lulars. Mitjançant immunodetecció de grups carbonil identificàrem 14 proteïnes selectivament oxidades, la majoria de les quals presentaven unió a magnesi, ja sigui directament unit per elles, o per mitjà de nucleòtids units a les esmentades proteïnes. Estudis in vitro van mostrar que l'oxidació d'aquestes proteïnes pot ser previnguda per magnesi i incrementada per ATP. A més, el ferro quelable va mostrar ser set vegades superior a les cèl·lules de la soca &#916;yfh1 i la seva disminució mitjançant un agent quelant, va aconseguir prevenir la inactivació dels enzims magnesi- dependents. Una de les proteïnes oxidades era la superòxid dismutasa 1 dependent de CuZn (CuZn-SOD), la qual mostrava nivells elevats de proteïna però es trobava parcialment inactivada. La relació entre la baixa activitat SOD, l'elevat contingut en ferro quelable i l'oxidació de proteïnes va ser estudiat amb més detall. Mitjançant l'addició de coure i manganès al medi de cultiu, es va aconseguir prevenir el dany oxidatiu específic a les proteïnes així com la seva inactivació. Així mateix, el mutant deficient en SOD1 va presentar elevats nivells de ferro quelable i inactivació d'enzims d'unió a magnesi. Aquests fets en el seu conjunt indiquen que la falta d'activitat SOD seria la responsable que els alts nivells de ferro puguin produir dany oxidatiu a les proteïnes en les cèl·lules &#916;yfh1.<br/>Finalment, hem desenvolupat un model cel·lular humà d'Ataxia de Friedreich utilitzant la línia SH-SY5Y diferenciada a fenotip neuronal. Després de la depleció de frataxina en l'esmentat model mitjançant RNA d'interferència, trobem la inducció d'ambdues superòxid dismutasas i la disminució en l'activitat CuZn-SOD. Aquestes dades reforcen la hipòtesi de que les alteracions en l'activitat de les superòxid dismutases poden jugar un paper rellevant en el desenvolupament de l'Ataxia de Friedreich.

El hierro juega un papel esencial en el metabolismo debido a su gran versatilidad como catalizador biológico, sin embargo, su acumulación ha sido asociada con diversas condiciones patológicas como por ejemplo la Ataxia de Friedreich. Esta enfermedad humana está causada por la disminución de la expresión de una proteína mitocondrial denominada frataxina. Un gran número de estudios utilizando diferentes modelos, relacionan a frataxina con el metabolismo de hierro ya que su deficiencia provoca la sobrecarga de este metal. La función precisa de la proteína es motivo de controversia. La mayoría de investigadores la consideran necesaria para la biosíntesis de los centros Fe-S ya que en su ausencia las actividades de enzimas con centros Fe-S se encuentran disminuidas. Muchos de los estudios realizados con el fin de conocer la función de frataxina han sido llevados a cabo en la levadura Saccharomyces cerevisiae, ya que frataxina y su homólogo en levadura YFH1 son ortólogos.<br/>Como punto de partida de esta tesis, nos planteamos el estudio del proteoma del mutante &#916;yfh1 en levadura como modelo de la Ataxia de Friedreich. La estrategia utilizada se basó en el uso de electroforesis bidimensional y posterior identificación de proteínas diferencialmente expresadas en mutantes &#916;yfh1 mediante huella de masas peptídicas. Este análisis proteómico, nos reveló que dichas células presentan un incremento en la cantidad de proteínas involucradas en la respuesta a estrés oxidativo. Entre las enzimas inducidas encontramos a las superóxido dismutasas 1 y 2, las cuales, sin embargo, mostraron menor actividad que la encontrada en las células control. Para el caso de la superóxido dismutasa dependiente de manganeso (Mn-SOD), este hecho paradójico era debido a una deficiencia en este metal, ya que al suplementar el medio de cultivo con manganeso, fueron restaurados tanto su contenido celular como la actividad Mn-SOD. Las actividades enzimáticas de cuatro proteínas que contienen centros Fe-S fueron analizadas, antes y después de la suplementación del medio de cultivo con manganeso. <br/>Las actividades de tres de ellas fueron restauradas, lo que indica que frataxina no és esencial para la biosíntesis de centros FeS. La cuarta proteína analizada, aconitasa, no recuperaba su actividad.<br/>El segundo objetivo fue realizar el análisis del daño oxidativo a proteínas -también referido como oxiproteoma- de las células deficientes en YFH1. La toxicidad del hierro está relacionada con su capacidad para generar especies reactivas del oxígeno (ROS), las cuales tienen el potencial para dañar los componentes celulares. Mediante inmunodetección de grupos carbonilo identificamos 14 proteínas selectivamente oxidadas, la mayoría de las cuales presentaban unión a magnesio, ya sea directamente unido por ellas, o por medio de nucleótidos unidos a dichas proteínas. Estudios in vitro mostraron que la oxidación de estas proteínas puede ser prevenida por magnesio e incrementada por ATP. Además, el hierro quelable mostró ser siete veces mayor en las células de la cepa &#916;yfh1 y su disminución mediante un agente quelante, logró prevenir la inactivación de las enzimas magnesio- dependientes. Una de las proteínas oxidadas fue la superóxido dismutasa 1 dependiente de CuZn (CuZn-SOD), la cual mostraba niveles elevados de proteína pero se encontraba parcialmente inactivada. La relación entre la baja actividad SOD, el elevado contenido en hierro quelable y la oxidación de proteínas fue estudiado con más detalle. Mediante la adición de cobre y manganeso al medio de cultivo, se logró prevenir el daño oxidativo específico a las proteínas así como su inactivación. Asimismo, el mutante deficiente en SOD1 presentó elevados niveles de hierro quelable e inactivación de enzimas de unión a magnesio. Estos hechos en su conjunto indican que la falta de actividad SOD sería la responsable de que los altos niveles de hierro puedan producir el daño oxidativo a las proteínas en las células &#916;yfh1.<br/>Por último, desarrollamos un modelo celular humano de ataxia de Friedreich utilizando la línea SH-SY5Y diferenciada a fenotipo neuronal. Tras la depleción de frataxina en dicho modelo mediante RNA de interferencia, encontramos la inducción de ambas superóxido dismutasas y la disminución en la actividad CuZn-SOD. Estos datos refuerzan la hipótesis de que las alteraciones en la actividad de las superóxido dismutasas pueden jugar un papel relevante en el desarrollo de la ataxia de Friedreich.

Iron plays an essential role in cellular metabolism due to its great versatility as a biologic catalyst. However, high tissue iron concentrations have been associated with several pathological conditions such as Friedreich Ataxia (FRDA). FRDA is caused by decreased expression of the mitochondrial protein frataxin. Many studies link frataxin to iron metabolism because its deficiency generates iron overload in different models. However, the precise function of this protein remains a matter of debate. Most researchers consider that Frataxin plays a role in iron-sulfur cluster biosynthesis because decreased activities of iron-sulfur containing proteins have been reported. Many studies in frataxin function arise from experiments performed with Saccharomyces cerevisiae, as frataxin and the yeast homologue Yfh1 are orthologues.<br/>In this work we analyzed the proteome of the yeast model of Friedreich Ataxia. The strategy used was based on the use of two-dimensional electrophoresis and subsequent identification of proteins differentially expressed in &#916;yfh1 cells by peptide mass fingerprinting. We found that these cells show an increased amount of proteins involved in the oxidative stress response, among them, Superoxide dismutase 1 and 2. However, these two enzymes showed decreased activity in &#916;yfh1 cells. In the case of superoxide dismutase manganese-dependent (Mn-SOD), this paradox was due to a deficiency in the cellular amount of manganese, because in cells grown in manganese-supplemented media, both Mn-SOD activity was restored. The activities of four Fe-S enzymes were analyzed for the effects of manganese supplementation.<br/>Enzyme activities were recovered by manganese treatment, except for aconitase, suggesting that frataxin is not essential for Fe-S clusters biosynthesis.<br/>We also analyzed oxidative damage to proteins in cells deficient in YFH1. Iron toxicity is related to its ability to trigger the generation of reactive oxygen species (ROS). These species are highly reactive and have the potential to damage cellular components. By carbonyl group inmunodetection we identified 14 proteins selectively oxidized, most of which showed binding sites to magnesium or nucleotides. In vitro studies showed that oxidation of these proteins can be prevented with magnesium, and increased by ATP. In addition, cheatable iron was found seven times increased in &#916;yfh1 cells. The use of a chelating agent, was able to prevent inactivation of magnesium dependent enzymes. Superoxide dismutase 1 (CuZn-SOD) was one of the oxidized proteins. This protein was partiality inactive. The relationship between low SOD activity, the high cheatable iron content and protein oxidation was studied in more detail. The addition of copper and manganese to the culture medium prevented both oxidative damage and inactivation of specific proteins. The mutant deficient in SOD1 showed high levels of chelatable iron and inactivation of magnesium-binding enzymes. These facts indicate that the absence of CuZn-SOD activity is the responsible for the high levels of chelatable iron that can cause oxidative damage to proteins in &#916;yfh1 cells.<br/>Finally, we developed a human cell model of Friedreich ataxia using the SH-SY5Y cell line differentiated to neuronal phenotype. Upon frataxin depletion in this model using interference RNA, we found induction of both superoxide dismutases and decreased CuZn-SOD activity.<br/>These data indicate that alterations in the activity of superoxide dismutases may play an important role in the development of Friedreich Ataxia.