Developmental switch on the signaling for cardiomyocyte death: Insights into the regulation of apoptotic gene expression and into the control of DNA fragmentation

Abstract

L'apoptosi s'ha considerat un factor important en el control del balanç entre proliferació cel·lular, diferenciació i mort durant el desenvolupament. La regulació de l'apoptosi és un factor clau per aconseguir aquest balanç, eliminant cèl·lules innecessàries o malmeses que, d'altra manera, podrien tenir efectes adversos per l'organisme. Durant la darrera dècada, molts treballs han demostrat que la senyalització per apoptosi té una funció vital per la morfogènesi del cor. Malgrat això, existeix controvèrsia sobre la implicació de les caspases en la mort dels cardiomiòcits en l'individu adult. Així, l'anàlisi de la regulació de l'apoptosi des d'una perspectiva de desenvolupament podria millorar el nostre coneixement sobre la funció de l'apoptosi al cor. Per tant, els nostres principals objectius han estat caracteritzar la regulació de l'expressió dels gens apoptòtics durant el desenvolupament cardíac i la identificació de les vies alternatives implicades al dany del teixit cardíac. Vàrem analitzar l'expressió de proteïnes implicades al control de la via de mort cel·lular dependent de caspases en teixits provinents de rates de diferents edats entre l'embrió i l'estadi adult. Els gens implicats en l'activació de l'apoptosi es troben fortament silenciats al cor adult i, la major part d'ells, també al cervell, però no al fetge. Les excepcions varen ser Caspasa-2, l'expressió de la qual es reprimeix a tots els teixits estudiats durant la fase embrional, i Bax i Bak, que es silencien en tots els teixits durant el període perinatal. L'expressió de la caspasa iniciadora Caspasa-9 i les caspases executores Caspasa-3 i Caspasa-7 es troba reprimida al cor i cervell postnatals. En relació amb els gens anti-apoptòtics, Bcl-2 es silencia al cor i el cervell durant el desenvolupament i no es va detectar al fetge, mentre que Bcl-XL s'expressa a tots els teixits fins l'estadi adult. Mitjançant l'anàlisi per RT-PCR semiquantitativa vàrem poder observar que la reducció en l'abundància de les proteïnes apoptòtiques durant el desenvolupament té lloc de forma paral·lela amb la reducció en els nivells dels seus mRNA. Durant la isquèmia experimental o el tractament amb la droga pro-apoptòtica estaurosporina, l'activació de la caspasa executora Caspasa-3 va observar-se només als cardiomiòcits embrionaris, però no als cardiomiòcits postnatals o adults. A més a més, la isquèmia va induir fragmentació de l'ADN que no es va poder evitar afegint inhibidors de caspases a cardiomiòcits postnatals en cultiu, que ja expressen nivells molt baixos d'aquests gens. Per continuar amb la investigació sobre la mort dels cardiomiòcits postnatals i el canvi d'una via dependent de caspases a una via independent de caspases durant el desenvolupament del cor, vàrem analitzar el possible rol de diverses DNAses que podrien estar implicades al dany a l'ADN durant la isquèmia. La repressió experimental en cultiu del gen Endonucleasa G (EndoG), que codifica per una nucleasa mitocondrial, va bloquejar la degradació de l'ADN durant la isquèmia, demostrant que EndoG té una funció molt important en aquest esdeveniment, de forma independent a les caspases. La sortida d'EndoG del mitocondri és un pas important per a la fragmentació de l'ADN als cardiomiòcits. Hem demostrat que Bcl -XL és capaç de bloquejar i Bnip3 contribueix a l'alliberament d'EndoG del mitocondri i, així, tenen efectes contraposats en la fragmentació de l'ADN durant la isquèmia als cardiomiòcits diferenciats. També vàrem iniciar l'anàlisi dels mecanismes que controlen l'expressió i silenciament dels gens apoptòtics al cor. Vàrem analitzar la contribució de dos candidats, E2F i les proteïnes d'unió a tractes de polipirimidines (PTB). Al cor, l'expressió d'E2F i PTB es redueix durant el desenvolupament, de forma paral·lela als gens apoptòtics. Malgrat això, l'anàlisi de l'expressió de gens apoptòtics a ratolins deficients per E2F1, E2F2 o tots dos gens no va mostrar cap canvi en relació amb els nivells d'expressió als seus respectius animals control ni durant l'estadi embrional ni durant el desenvolupament postnatal. Aquests resultats varen descartar que E2F tinguin una funció rellevant en el control de l'expressió dels gens apoptòtics al cor, a diferència del que s'ha observat en línies cel·lulars tumorals. D'altra banda, vàrem trobar que, en cardiomiòcits neonatals, que expressen nivells molt baixos de PTB, la sobrexpressió de PTB1 o PTB4 va induir la reexpressió de molts gens apoptòtics, incloent Apaf-1, les caspases-9 i -3, i Bid. A més a més, els cardiomiòcits sobre-expressors de PTB varen patir major dany a l'ADN durant la isquèmia que els cardiomiòcits control i aquest increment podia ser inhibit mitjançant inhibidors de caspases fins a nivells similars als de cèl·lules no sobreexpressores. Això suggereix que la recuperació de l'expressió de PTB, probablement implicant l'increment de l'expressió de gens apoptòtics, va induir un canvi a un mecanisme implicant les caspases. La re-expressió de PTB va induir un increment en la quantitat de proteïnes apoptòtiques sense afectar els nivells dels seus respectius mRNA. Els assaigs luciferasa (Luc) en cardiomiòcits normals i sobre-expressors de PTB, utilitzant plàsmids bicistrònics en els quals es va integrar la regió 5'-no codificant (5'-UTR) dels transcrits d'Apaf-1 o Caspasa-3 entre LucRenilla i LucFirefly, varen demostrar un increment en l'activitat LucFirefly quan qualsevol de les dues 5'-UTR es trobava present, comparat amb els nivells control. Aquests resultats suggereixen que PTB indueixen traducció per la via Internal Ribosolmal Entry Site (IRES), que requereix certes seqüències a les regions 5'-UTR dels gens implicats.