Spinal cord motoneurons,morphological and molecular study during development and pathology

Abstract

La identificació dels mecanismes moleculars que regulen la supervivència i mort de les motoneurones representa una informació important per a la comprensió funcional i l'establiment de potencials dianes terapèutiques per a les malalties que cursen amb degeneració i mort d'aquestes neurones. Per aquest motiu hem dedicat aquest treball a:<br/>a) L'estudi dels mecanismes intracel·lulars dependents de calci que modulen la supervivència de les motoneurones durant el desenvolupament.<br/>Com a efecte inductor de supervivència hem analitzat la participació de la proteïna quinasa dependent de Ca2+/Calmodulina IV (CaMKIV) en motoneurones embrionàries de pollastre, i demostrem que la seva activació calci dependent indueix la fosforilació d'Akt i la supervivència d'aquestes neurones. Per altra banda, com a efecte inductor de mort demostrem que els increments excessius de la concentració del calci intracel·lular induïts per la despolarització de la membrana, són responsables de l'activació de la proteasa Calpaïna i la conseqüent degeneració de les motoneurones de ratolí. Proposem la inhibició de Calpaïna com a mecanisme neuroprotector.<br/>b) La generació d'un model in vitro per a l'estudi dels mecanismes patològics que causen la degeneració específica de les motoneurones en Atròfia Muscular Espinal.<br/>En aquesta segona part del treball, amb la finalitat de contribuir a la comprensió de la fisiopatologia d'aquesta malaltia hem desenvolupat un model in vitro utilitzant tècniques d'interferència d'RNA. Reduïm l'expressió de la proteïna Survival Motoneuron (SMN) en les motoneurones fins a nivells representatius de la forma severa de la malaltia. L'estudi morfològic i de viabilitat en aquestes cèl·lules ens facilitarà la identificació dels mecanismes moleculars implicats en la malaltia.<br/>Els resultats presentats en aquesta tesi impliquen l'activació de CaMKIV en la regulació de la supervivència de les motoneurones; proporcionen nous coneixements sobre les vies de regulació que en provoquen la seva degeneració (nivells de potassi elevats al medi extracel·lular i Calpaïna), i demostren alteracions d'aquestes neurones en un models d'Atròfia Muscular Espinal (degeneració neurítica i mort).

La identificación de los mecanismos moleculares que regulan la supervivencia y muerte de las motoneuronas representa una información importante de conocimiento básico y para el establecimiento de potenciales dianas terapéuticas para las enfermedades que cursan con degeneración y muerte de estas neuronas. Por este motivo hemos dedicado este trabajo al estudio de:<br/>a) Mecanismos intracelulares básicos dependientes de calcio que modulan la supervivencia de las motoneuronas durante el desarrollo.<br/>Como efecto inductor de supervivencia hemos analizado la participación de la proteína quinasa dependiente de Ca2+/Calmodulina IV (CaMKIV) en motoneuronas embrionarias de pollo, y demostramos que su activación calcio dependiente, induce la fosforilación de Akt y supervivencia de estas neuronas. Por otro lado, como a efecto inductor de muerte demostramos que incrementos de la concentración del calcio intracelular inducidos por la despolarización de la membrana, son responsables de la activación de la proteasa Calpaína y la degeneración de las motoneuronas de ratón. Nuestros resultados apoyan el uso de inhibidores de Calpaína como estrategia neuroprotectora.<br/>b) Mecanismos patológicos que causan la degeneración específica de las motoneuronas en Atrofia Muscular Espinal.<br/>En esta segunda parte del trabajo, con la finalidad de contribuir a la comprensión de la fisiopatología de esta enfermedad hemos desarrollado un modelo in Vitro utilizando técnicas de interferencia de RNA. Reducimos la expresión de la proteína Survival Motoneuron (SMN) en las motoneuronas hasta niveles representativos de la forma severa de la enfermedad. El estudio morfológico y de viabilidad en estas células nos facilitará la identificación de los mecanismos moleculares implicados en la enfermedad.<br/>Los resultados que presentamos en esta tesis implican la activación de CaMKIV en la regulación de la supervivencia de las motoneuronas; proporcionan nuevos conocimientos sobre las vías de regulación que provocan su degeneración (niveles de potasio elevados al medio extracelular y Calpaína), así como alteraciones específicas de estas neuronas en modelos de Atrofia Muscular Espinal (degeneración neurítica y muerte).

Identification of molecular mechanisms that regulate motoneuron survival and death represent valuable basic knowledge to elucidate potential therapeutic targets for those diseases that imply motoneuron degeneration and death. For this reason in the present work we studied:<br/>a) Basic calcium-dependent intracellular mechanisms which modulate motoneuron survival during development.<br/>As a pro-survival effect we analysed the role of the calcium/calmodulin dependent protein kinase IV (CaMKIV) in cultured chicken motoneurons. Results demonstrated that CaMKIV activation induces Akt phosphorylation and motoneuron survival. On the other hand, as a prodegenerative effect we demonstrate that in mouse motoneurons depolarization induced excessive calcium influx activates the protease Calpain and causes motoneurons death. Our results suggest that Calpain inhibitors may induce neuroprotective effects.<br/>b) Intrinsic motoneuron pathological mechanisms underlying Spinal Muscular Atrophy.<br/>In this second part, with the aim to facilitate the understanding of the physiopathology of SMA we developed an in vitro model using RNA interference techniques. We reduce Survival Motoneuron (SMN) protein expression in motoneurons to representative levels from severe Spinal Muscular Atrophy mouse models. Morphologic and survival analysis of these cultured neurons may contribute to the identification of pathologic molecular mechanisms implicated in the disease.<br/>Reported results, obtained from the morphological and molecular analysis of primary motoneuron cultures, provide new knowledge on motoneuron development and survival regulating pathways (implication of CaMKIV activation in motoneuron survival regulation), about regulation pathways involved in motoneuron degeneration (high potassium extracellular levels and Calpain activation), as well as motoneuron alterations in a severe SMA culture model (neurite degeneration and death).